人骨髓间充质干细胞向软骨诱导分化的基础研究

论文摘要

软骨缺损的修复一直是矫形外科的难题。早期开展的微骨折技术、骨膜软骨膜移植、软骨细胞移植等方法都存在诸多问题。上世纪80年代开始,组织工程的发展和应用为软骨缺损和修复带来了新的希望。支架材料、生长因子、种子细胞是组织工程的三要素,随着制造技术的进步,支架材料的研究已取得突飞猛进的进展,已有人工骨应用于临床。而目前种子细胞是制约组织工程发展的瓶颈之一。骨髓间充质干细胞因其成体干细胞特征和易获取性,近年来倍受关注。但是,骨髓间充质干细胞的分离、纯化、鉴定以及多向分化条件和机理等目前都不十分清楚。不论是基础研究还是临床应用,人们都希望获得稳定的、纯化的、大量具有骨髓基质干细胞生物学表型和功能的种子细胞,以便为基础研究提供标准的细胞,为临床应用提供细胞库,真正实现体外构建组织器官的目的。为了达到以上目的,最佳途径就是建立骨髓间充质干细胞的细胞系。目的:探索骨髓间充质干细胞培养条件。观察间充质干细胞生物学行为和向软骨诱导分化的能力。以供组织工程基础研究及骨科临床应用。方法:抽取5例健康志愿者骨髓,每例约4ml,利用含Hyclone胎牛血清的DMEM低糖培养液培养,进行细胞培养并探索条件。取正常骨髓做骨髓间充质干细胞的原代培养和传代培养,对该细胞进行流式细胞分析鉴定,根据临床研究与应用需求诱导分化,配制条件培养液。采用软骨诱导条件培养基:完全培养基加地塞米松、TGF-β1、维生素C,终浓度为, 5ug/L, 10mmol/L; BMSCs细胞进行软骨细胞诱导6, 12, 18, 24d,相差显微镜观察,HE染色观察细胞形态;免疫细胞化学染色观察软骨细胞诱导II型胶原的表达,原位杂交观察软骨细胞诱导II型胶原mRNA表达结果:10%的血清最有利于细胞生长,Percoll细胞分离液分离细胞可以得到更纯化的细胞,细胞首次换液时间为6天。对传代培养细胞进行流式细胞分析鉴定,细胞表达CD29, CD71, CD106,不表达CD34, CD45,表明培养细胞是间充质干细胞。hBMSC细胞可以条件诱导为软骨,具有成体干细胞的特征。结合细胞表面分子检测结果,可以认为BMSCs细胞为骨髓内的间充质质干细胞。结论:人骨髓间充质干细胞优化培养条件:10%胎牛血清、DMEM低糖培养基,首次换液时间为6天,密度梯度离心法分离细胞有利于获得较纯化的细胞,全骨髓贴壁分离法更有利于细胞生长;可培养出纯化的人骨髓间充质干细胞,细胞不表达造血系细胞表面特异分子,并具备多向分化的成体干细胞特征;人骨髓间充质干细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 缩略语表
• （四） 前言
• （五） 材料和方法
• （六） 结果
• （七） 讨论
• （八） 结论
• （九） 附图
• （十） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢