论文题目: BTB基因家族成员BTBD8、KLHL7和KLHL9的克隆和功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 徐坚
导师: 谢毅
关键词: 结构域,结构域,酵母双杂交,细胞定位,免疫共沉淀,锤头状核酶
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: BTB结构域和kelch结构域都是在进化上高度保守的结构域,广泛存在于从酵母到人类的各种物种中。在人类基因组中发现了很多BTB/kelch蛋白,提示这类蛋白功能的重要性和多样性。现在越来越多的实验证据证明BTB/kelch蛋白在胞质分裂、细胞骨架功能维持、细胞周期调控、肿瘤发生、神经发育等重要生理过程中都起了重要的作用。BTB结构域的主要功能是介导蛋白相互作用,它在PLZF和BCL6等转录因子的转录调控和参与Cul3介导的泛素途径中都有重要作用。kelch蛋白是近年来发现的一类新的细胞骨架结合蛋白,可以与actin细胞骨架作用从而对细胞骨架功能进行调控。更多的研究表明kelch结构域的功能多样化,参与了一系列重要的信号传导途径,在细胞周期调控和肿瘤发生中都发挥了重要作用。例如,研究发现NRP/B可以与核骨架结构作用,并且NRP/B受到p53的转录调控,进而影响ERK/MAPK途径和AKT途径。ENC-1可以与非磷酸化的p110Rb蛋白相互作用而影响神经元的细胞周期和分化,在脂肪细胞分化和结肠癌发生中ENC-1也起了重要的作用。对人类Mayven蛋白的最新研究表明Mayven在乳腺癌的发生中起了重要作用,Mayven可以通过激活AP-1、c-jun、cyclin D等的表达对细胞周期进行调控。 我们从本实验室的高质量人胎脑文库中克隆得到了三个含有BTB结构域的新成员:BTBD8、KLHL7和KLHL9,并且KLHL7和KLHL9同时含有kelch-repeat结构域。通过信息学分析发现我们得到的BTBD8、KLHL7和KLHL9的cDNA均为全长形式,它们分别编码含有305个氨基酸、538个氨基酸和617个氨基酸的蛋白,并且都含有保守的BTB结构域和kelch结构域。通过Northern杂交、RT-PCR和原位杂交等实验,我们发现了它们各自特异的表达谱模式:BTBD8在8种胎儿组织中广泛表达而在16种成人组织中表达量都很低,这种表达模式提示BTBD8可能在发育过程中起一定的作用;KLHL7在多种肿瘤组织和细胞系中表达并且在胰腺癌组织中表达量显著高于癌旁组织,提示其在肿瘤发生中可能起了重要作用;KLHL9在胎儿肝组织中表达显著高于成人肝组织,提示在胎儿肝组织中行使一些重要功能。对这三个基因的细胞定位研究发现BTBD8在AD293细胞中为细胞核定位而在NIH3T3细胞中为全细胞定位,提示在这两种细胞系中可能有不同的功能。而对KLHL7和KLHL9的定位研究发现它们的BACK结构域对定位都有重要作用。利用免疫共沉淀实验我们确定了KLHL7和KLHL9都能与actin结合,提示KLHL7和KLHL9可能在维持细胞骨架功能和参与骨架信号传导中有重要作用。
论文目录:
中文摘要
英文摘要
英文缩略词
第一章 前言
第二章 材料和方法
1．材料和试剂
2．方法
第三章 实验结果
第一节 KLHL9基因的克隆和功能研究
一．KLHL9基因的克隆和信息学分析
二．KLHL9基因的表达谱分析
三．BACK结构域对亚细胞定位的影响
四．BTB结构域介导的二聚体化和泛素化
五．KLHL9与actin的相互作用
六．KLHL9对细胞周期的影响
七．KLHL9对细胞骨架稳定性的影响
八．相互作用蛋白筛选
第二节 KLHL7基因的克隆和功能研究
一．KLHL7基因的克隆和信息学分析
二．KLHL7基因的组织表达谱分析
三．BTB结构域介导的二聚体化
四．KLHL9与actin的相互作用
五．BACK结构域对亚细胞定位的作用
六．相互作用蛋白筛选
七．KLHL7的细胞学功能研究
八．酵母互补实验准备
第三节 BTBD8基因的克隆和功能研究
一．BTBD8基因的克隆和信息学分析
二．BTBD8基因的表达谱分析
三．BTBD8的胞内定位分析
第四章 讨论
一．表达谱模式分析
二．BTBD8基因的功能探讨
三．KLHL9和KLHL7基因的功能探讨
小结
参考文献
综述
参考文献
攻读博士学位期间发表论文
致谢
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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