论文摘要
骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs）因其诸多优势而被认为是细胞移植治疗心肌梗死（myocardial infarction, MI）的一种理想种子细胞。然而,移植后心脏微环境诱导的MSCs大规模凋亡严重制约了这一技术的治疗效果。深入了解心脏微环境（缺血缺氧,氧化应激）诱导骨髓间充质干细胞的凋亡机制,有助于寻找提高干细胞存活能力的作用靶点,为今后的研究和应用提供有效的理论基础。microRNA （miRNA）作为一类细胞内重要的调控分子,已被发现在多种细胞的凋亡信号转导通路中发挥了关键作用,然而目前尚缺乏针对骨髓间充质干细胞凋亡过程中miRNA表达水平的整体分析以及相关的功能研究。为了研究miRNA在心脏微环境诱导MSCs凋亡过程中所发挥的作用,并探讨miRNA表观遗传修饰是否能够影响MSCs移植后的存活能力和治疗效果。我们体外利用缺氧无血清诱导MSCs凋亡模拟缺血心肌微环境,筛选鉴定在这一过程中发挥重要作用的miRNA,并进行相关机制探讨；进一步利用过氧化氢处理MSCs模拟心肌梗死后的氧化应激反应,寻找在两种刺激下都有抗凋亡效应的miRNA（抗凋亡niRNA）;继而转染该类miRNA至MSCs,并移植大鼠心梗模型,分析抗凋亡miRNA表观遗传修饰后对MSCs治疗心肌梗死的影响。研究内容主要包括如下3个部分：第一部分缺氧无血清诱导MSCs凋亡相关miRNA的鉴定1、缺氧无血清诱导MSCs凋亡过程中miRNA的表达谱分析。制备大鼠骨髓间充质干细胞缺氧无血清（6小时）凋亡模型,利用TLDA芯片技术进行miRNA表达谱分析,结果显示60种miRNA发生表达变化（Ct<36, Fold>1.9）,其中57种上调,3种下调。结合相关报道及生物信息学分析,我们选取10种miRNA进行TaqMan qRT-PCR验证,发现MSCs缺氧无血清处理6小时后,miR-21, miR-23a, miR-34a, miR-210, miR-503等5种miRNA表达显著上调1.5倍以上,并在缺氧无血清处理MSCs过程中呈现动态变化。2、miRNA在MSCs凋亡过程中的功能分析。利用miRNA模拟物（mimics）/抑制剂（inhibitors）转染MSCs,过表达/抑制miR-21, miR-23a, miR-34a, miR-210,miR-503等5种miRNA,再进行缺氧无血清处理6小时,继而用流式细胞技术（Annexin V/PI双染）分析细胞凋亡情况,结果发现：①过表达miR-21, miR-23a和miR-210能够提高MSCs在缺氧无血清环境下的存活能力；②抑制miR-21,miR-23a和miR-503会导致细胞存活水平明显下调；③过表达miR-34a, miR-503;抑制mR-34a, miR-210均不会对MSCs整体的存活能力造成影响。3、miRNA对MSCs凋亡过程中Caspase-3/7活性的影响。在MSCs中过表达miR-21, miR-23a, miR-34a, miR-210和miR-503,并缺氧无血清处理6小时之后利用Caspase-Glo 3/7试剂分析这些miRNA对Caspase-3/7活性的影响,发现miR-21,miR-23a和miR-210能够显著抑制缺氧无血清后的Caspase-3/7活性,其它2种miRNA则对Caspase-3/7活性没有明显作用。4、miRNA对MSCs凋亡过程中线粒体膜电位的影响。JC-1染料检测线粒体膜电位实验表明,过表达miR-21和miR-23a能显著维持线粒体的膜电位水平,提示这两种miRNA通过线粒体途径保护缺氧无血清诱导的凋亡作用。miR-210则对MSCs凋亡过程中的线粒体膜电位没有挽救作用。第一部分结果小结：缺氧无血清诱导的MSCs凋亡过程中miRNA表达谱发生了变化（57种miRNA表达上调,3种下调）,其中miR-21和miR-23a可以通过保护线粒体膜的完整性并抑制Caspase-3/7活性,进而实现对MSCs的抗凋亡作用。miR-210尽管对线粒体没有保护作用,但该miRNA可能通过其它途径提高了MSCs在缺氧无血清条件下的存活能力。第二部分miR-21抑制氧化应激诱导的MSCs凋亡1、过氧化氢处理能上调MSCs中miR-21的表达水平。利用过氧化氢（H202）200μM处理MSCs 4小时制备氧化应激模型,TaqMan qRT-PCR检测]miR-21, miR-23a和miR-210表达变化,发现只有miR-21明显上调2倍以上。2、miR-21对H202诱导的MSC凋亡具有保护作用。过表达miR-21, miR-23a和miR-210的MSCs用H2O2 （200μM）处理4小时,用流式细胞仪（Annexin V/PI双染）分析细胞凋亡水平,并用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测LDH的释放水平。结果发现,miR-21能够显著抑制过氧化氢处理后的细胞凋亡水平,同时能够抑制LDH释放,表明miR-21对氧化应激诱导的MSC凋亡具有保护作用；而miR-23a和]miR-210则没有明显效果。3、miR-21可以抑制H202处理后MSCs的Caspase-3/7活性。利用Caspase-Glo3/7试剂盒检测过表达miR-21的MSCs在H2O2 （200μM）处理4小时后的Caspase-3/7活性。检测结果显示,过表达miR-21组MSCs的Caspase-3/7活性明显低于对照组,表明miR-21可能通过抑制氧化应激刺激下MSCs的Caspase-3/7活性,提高了MSCs的抗凋亡能力。4、MSCs中过表达miR-21能抑制H202诱导的PDCD4上调。Western Blot检测MSCs中PDCD4的表达水平,结果发现,H202处理能够显著提高PDCD4的表达水平；过表达miR-21能够抑制H202诱导的PDCD4表达上调；抑制miR-21表达则促进PDCD4表达。如上结果提示miR-21可能通过抑制PDCD4来抵抗H202诱导的MSCs凋亡第二部分结果小结：在缺氧无血清胁迫下具有抗凋亡能力的3种niRNA （miR-21, miR-23a和miR-210）中,miR-21不仅能够提高缺氧无血清处理后MSCs的存活能力,还能通过抑制Caspase-3的活化和PDCD4基因的表达,有效抵抗H202诱导的MSC凋亡。提示miR-21有可能是提高MSCs移植后存活能力的有效靶点。第三部分miR-21表观遗传修饰改善MSCs移植缺血心肌后的存活能力和心功能1、移植miR-21表观遗传修饰的MSCs至心梗大鼠。雌性SD大鼠左冠状动脉前降支结扎建立心梗模型,随机分成4组,包括：（A）Sham组：假手术组；（B）MI/IMDM:注射无血清IMDM; （C） MI/miRsc-MSC:移植转染了miRNA mimics scramble（阴性对照）的MSCs; （D） MI/miR21-MSC:移植过表达miR-21的MSCs。每组每个时间点n=6,细胞注射量均为4×106。注射前转染miR-21 mimics至MSCs,构建miR-21表观遗传修饰的MSCs。2、miR-21能提高移植后MSCs的存活水平。（C）组、（D）组大鼠分别在1天和1周取材,提取大鼠心脏组织基因组DNA,利用Real Time PCR进行SRY基因的扩增,评估移植后MSCs的存活水平。结果显示miR-21表观遗传修饰的MSCs移植后存活率显著增加。3、miR-21能抑制移植后的MSCs凋亡。（C）组、（D）组大鼠分别在1天和1周取材制备冰冻切片,进行TUNEL染色检测移植后MSCs的凋亡水平。结果显示,过表达miR-21的MSCs的细胞凋亡率显著低于对照组。4、miR-21能促进MSCs移植后对心功能的改善。（A）、（B）、（C）、（D）组大鼠在MSCs移植后4周进行超声心动图检测,评价左室功能。结果显示,与（B）Sham组相比,（C）、（D）组移植MSCs都能够有效改善心梗后的心功能（n=6,p<0.05）；与（C）组比较,（D）组miR-21遗传修饰的MSCs在移植梗死心脏后具有更好的改善心功能作用（n=6,p<0.05）。第三部分结果小结：miR-21表观遗传修饰能够抑制缺血心肌微环境诱导的细胞凋亡,显著提高移植后MSCs的存活率,显著增强MSCs移植干预心肌梗死的疗效。本研究首次分析了缺氧无血清诱导骨髓间充质干细胞凋亡过程中miRNA的表达谱变化,筛选到MSCs凋亡相关miRNA;利用miRNA对MSCs进行表观遗传修饰,并移植缺血心肌,监测其对植入细胞存活能力和心功能的影响,首次将抗凋亡miRNA靶点治疗,表观遗传修饰,以及细胞治疗的理念实现了有机整合,为改善利用MSCs治疗心肌梗死的临床效果提供了新思路。鉴于miRNA自身的多方面优势（调控温和,靶点多,反应快,效率高,易操作等）,开发miRNA遗传修饰的细胞移植有着广阔的应用前景。
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