MiRNA在肺损伤与修复中的作用机制研究

论文摘要

肺损伤的分子机制研究还十分不完善,尤其在肺纤维化和免疫复合物致肺损伤领域,大量研究工作有待进行。微小RNA （miRNA）平均由22个核苷酸组成,为单链,非编码的RNA。目前认为miRNA是一类非常重要的机体调控因子,成熟的miRNA可以标靶mRNA的3’端非编译区或者编译区,从而沉默标靶基因,并且在诸多病理生理过程中发挥着非常重要的生物调节作用。为了研究miRNA在肺纤维化中的调节作用,我们提取了博来霉素致肺纤维化小鼠模型各个时间点的肺总RNA,采用含1810个探针的miRNA芯片进行miRNA高通量检测,比较博来霉素作用不同时间点与对照组肺总RNA中差异表达的miRNA。研究得到161个与正常组有差异表达的miRNA。同时分析了肺纤维化模型早期和晚期病理进程中差异表达的miRNA。应用生物信息学方法,对不同病理进程中差异表达的miRNA进行了靶点预测分析。这些重要的miRNA包括let-7f, let-7g, miR-127, miR-196b,miR-16, miR-195, miR-25, miR-144, miR-351, miR-153, miR-468, miR-449b,miR-361, miR-700, miR-704, miR-717, miR-10a, miR-211, miR-34a, miR-367,and miR-21.将预测miRNA靶点进行归类分析,得到在肺纤维化重要病理环节,包括凋亡、炎症反应及纤维化中的重要分子通路,如凋亡信号通路、Wnt信号通路、Toll受体和组织生长因子通路中密切相关的miRNA及其靶点基因。我们的研究揭示了肺纤维化过程中不同程度差异表达的miRNA,同时预测出miRNA可能调控的肺纤维化病理过程中重要的分子通路。另外,我们发现miR-127在肺部损伤炎症反应阶段时表达下调。基于此,我们探究了miR-127在肺损伤和炎症中的作用机制。我们发现过表达miR-127的巨噬细胞炎性刺激物作用后,产生的细胞因子[白介素-6（IL-6）,白介素1p （IL-1β）,组织坏死因子（TNF-α）]释放减少。生物信息学分析发现免疫球蛋白G （IgG） Fcγ受体I（FcyRI/CD64）可能是miR-127的靶点基因。基因芯片,蛋白定量表达分析分别确证了miR-127在mRNA和蛋白水平对CD64的调控。通过构建含CD64-3’UTR的荧光报告质粒,我们明确了miR-127对CD64的直接标靶关系。另外体内实验更进一步发现,鼻内滴注miR-127可以减少IgG免疫复合物（IgG IC）所导致的急性肺内损伤和炎症反应。包括肺组织形态学观察,细胞因子IL-6, TNF-a,巨噬细胞炎性蛋白1β（MIP-1β）,巨噬细胞炎性蛋白-2（MIP-2）单核细胞趋化蛋白（MCP-1）,趋化因子CXC配体-1（KC）的检测,肺渗透性检测,补体C5a以及急性期应答因子信号传导子及转录激活子3（STAT3）的蛋白水平检测。因此,我们认为miR-127通过标靶巨噬细胞CD64表达,从而减轻肺内IgG IC所致的炎性反应。总之,我们研究了肺纤维化中各特定时间点和特定病理阶段差异表达的miRNA,并且对这些miRNA进行了标靶基因预测,通过将这些标靶基因与特定病理阶段的分子信号通路对应起来,我们分析得到了各个病理阶段miRNA可能发挥作用的分子信号通路。通过对miR-127在炎症反应中的作用机制研究,我们确定了miR-127的作用靶点基因CD64,并发现了miR-127对IgG IC所致急性肺损伤的保护作用。对miRNAs调节肺内纤维化和炎性反应机制的研究揭示了miRNA在调控感染性及非感染性肺损伤炎性反应的重要作用,为今后肺纤维化及肺损伤炎症反应的新药研究提供有力依据。本课题研究了miRNA在肺损伤和修复中的作用机制。第一部分研究内容：博来霉素致肺纤维化的miRNA复杂性分析揭示多途径分子机制研究,撰写论文已发表在Physiological Genomics（影响因子：3.931）杂志上。第二部分研究内容：miR-127调节肺内炎症反应的机制研究,也已被Journal of Immunology（影响因子：6.0）杂志接收,预计在近半年内发表。本研究内容属国内外研究热点,研究方法属国内外领先水平。中医药是世界医学不可缺少的组成部分,在中华传统文明中占有一席之地,是中华人民世代相传的文化宝藏,至今发挥着治疗众多疾病的重大作用。本研究可为今后中医药研究搭建高水平高质量的研究平台,为研究中医药治疗肺部疾病提供有先进的研究方法和技术。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 文献综述
• miRNA与肺部疾病的研究进展
• 1 microRHA（miRNA）
• 2 miRNA与肺部疾病
• 3 miRNA芯片技术
• 4 展望
• 参考文献
• 中医药标靶肺纤维化病理信号因子的研究进展
• 1 中医药对调亡信号通路因子的作用研究
• 2 中医药对炎症信号通路因子的作用研究
• 3 中医药对纤维化信号通路因子的作用研究
• 4 多途径调节作用
• 5 抗纤维化机制尚不清楚
• 6 展望
• 参考文献
• 前言
• 博来霉素致肺纤维化的MIRNA复杂性分析揭示多途径分子机制
• 1 实验材料和方法
• 1.1 动物
• 1.2 RNA提取和定量
• 1.3 MiRNA芯片技术
• 1.4 MiRNA芯片数据分析
• 1.5 MiRNA靶点基因预测和信号通路分析
• 2 结果
• 2.1 博来霉素致肺纤维化模型肺内miRNA表达及对序性分析
• 2.2 博来霉素致肺纤维化特征性病理过程的miRNA差异表达
• 2.3 博来霉素致肺纤维化差异表达miRNA的靶点预测
• 2.4 MiRNA基因靶点的信号通路分析
• 3 讨论
• 3.1 博来霉素作用早期差异表达的miRNA与凋亡、炎症相关的信号通路
• 3.2 博来霉素作用后期差异表达miRNA标靶纤维化相关信号通路
• 4 图表
• COMPREHENSIVE MICRORNA ANALYSIS IN BLEOMYCIN-INDUCED PULMONARYFIBROSIS IDENTIFIES MULTIPLE SITES OF MOLECULAR REGULATION
• 1 MATERIALS AND METHODS
• 1.1 Animals
• 1.2 Bleomycin administration
• 1.3 RNA isolation and quality assessment
• 1.4 MiRNA microarray hybridization
• 1.5 MiRNA microarray analysis
• 1.6 Gene target prediction for miRNAs and pathway analysis
• 2 RESULTS
• 2.1 MiRNA expression patterns in lung tissues of bleomycin model
• 2.2 Differential miRNA expression during distinct pathologic phases of bleomycin-induced lung fibrosis
• 2.3 Predicted gene regulation by differentially expressed miRNA during bleomycin-induced lung fibrosis
• 2.4 Pathway analysis of miRNA targets
• 3 DISCUSSION
• 3.1 Apoptosis and inflammation-related pathways were targeted by miRNAs in the initial period of bleomycin injury
• 3.2 Fibrosis related signaling pathway was targeted by miRNAs in the late period of bleomycin injury
• 4 TABLES
• 5 REFERENCES
• MIRNA-127通过标靶IGG FC（?）受体1抑制肺部炎症反应
• 1 实验材料和方法
• 1.1 试剂
• 1.2 miRNA核苷酸片断
• 1.3 动物
• 1.4 博来霉素致肺纤维化动物模型
• 1.5 RNA检测
• 1.6 细胞培养
• 1.7 稳定过表达miR127细胞系的建立
• 1.8 基因序列分析
• 1.9 细胞因子和补体蛋白检测
• 1.10 蛋白定量检测
• 1.11 荧光素酶报告基因质粒的构建和检测
• 1.12 流式细胞技术
• 1.13 IgG IC致肺损伤模型的建立
• 1.14 病理组织学
• 1.15 统计学方法
• 2 结果
• 2.1 肺内损伤可调节miR-127的表达
• 2.2 过表达miR-127 MH.S细胞系的建立
• 2.3 过表达miR-127可以降低LPS、PGN、HA和IgG IC引起的细胞因子释放
• 2.4 CD64是miR-127的靶点
• 2.5 CD64与IgG IC引起的炎症反应正相关
• 2.6 miR-127可以抑制小鼠体内IgG IC所致的炎症反应
• 3 讨论
• 4 图表
• MIRNA-127 INHIBITS LUNG INFLAMMATION BY TARGETING IGG FC RECEPTOR I
• 1 MATERIALS AND METHODS
• 1.1 Reagents
• 1.2 miRNA oligonucleotides
• 1.3 Animals
• 1.4 Bleomycin administration
• 1.5 RNA analysis
• 1.6 Cells
• 1.7 Expression constructs and stable transduction
• 1.8 Microarray analysis
• 1.9 Cytokine and complement production
• 1.10 Protein analysis
• 1.11 Luciferase assay
• 1.12 Flow cytometry
• 1.13 IgG IC-induced lung injury
• 1.14 Histology
• 1.15 Statistics
• 2 RESULTS
• 2.1 Mature miR-127 was regulated during inflammation
• 2.2 Establishment of miR-127 over-expression in MH.S cells
• 2.3 Over-expression of miR-127 decreased LPS-, PGN-,HA-,and IgG IC-induced cytokine expression
• 2.4 CD64 is a target of miR-127
• 2.5 Expression of CD64 is positively correlated to IgG IC-induced inflammatory response
• 2.6 MiR-127 inhibit inflammation response by IgG IC in vivo
• 3 DISCUSSION
• 4 REFERENCES
• 致谢
• 个人简历
• 附图