论文摘要
附红细胞体与血巴尔通氏体在分类上归属于立克次氏体目(Rickettsiales)无形体科(Anaplsmataceae)，主要寄生于各种动物红细胞表面或游离于血浆中，因而也称为母血营养菌(haemotrophic bacteria)。病原体寄生使红细胞膜结构发生变化，导致红细胞损伤，引起感染动物临床表现贫血、黄疸和发热等症状。自上个世纪70。年代开始报道人类的附红细胞体感染以来，这类母血营养菌的危害性越来越受到人们的关注。长期以来，对附红细胞体和血巴尔通氏体的分类学地位一直存在争议，在1984年出版的《伯杰细菌鉴定手册》中，将这类主要寄生于红细胞表面的微生物列入立克次氏体目(Rickettsiales)无形体科(Anaplasmataceae)，与无形体属(Anaplasma)平行，分属于附红细胞体属(Eperythrozoon)和血巴尔通氏体属(Haemobartonella)。本研究利用原核生物16S rRNA基因通用引物27F和1492R对分离纯化的疑似牛血巴尔通氏体和奶牛附红细胞体进行16S rRNA基因的PCR扩增及克隆测序。测序结果表明，本试验分离的两株牛血巴尔通氏体(EF424082和EF460765)16S rRNA基因片段长度分别为1434bp和1435bp，两者相似性高达99％，皆与国外已发表的猫血巴尔通氏体(AF178677)和犬血巴尔通氏体(AY529641)16S rRNA基因片段核苷酸序列相似性分别为94.5％和94.7％。因此从分子水平上证实了试验血液中确实存在牛血巴尔通氏体病原；但由于与猫血巴尔通氏体的核苷酸序列相差5.5％，与犬血巴尔通氏体的核苷酸序列相差5.3％，由此得知本试验分离得到的牛血巴尔通氏体与国外发表的猫血巴尔通氏体和犬血巴尔通氏体的基因型存在一定的差异，这对该病的分子流行病学分析具有一定的意义。另外本试验扩增出了一条长度为1453bp牛温氏附红细胞体(EF221880)16s rRNA基因片段，与本实验室发表的牛温氏附红细胞体(AY769973)的16S rRNA基因片段核苷酸序列相似性高达99.8％，与国内湖北株牛温氏附红细胞体(AY946266)的16S rRNA基因片段核苷酸序列相似性为97.7％，与国外已发表的牛温氏附红细胞体(AF016546)的16S rRNA基因片段核苷酸序列相似性为97.4％。本研究基于16S rRNA基因的序列资料的系统进化分析表明，以前所命名的附红细胞体和血巴尔通氏体处于同一进化分支上，应合并为同一个属，这类母血营养菌与柔膜体纲(Mollicures)、支原体科(Mycoplasmamatales)、支原体属(Mycoplasma)的病原最靠近，试验结果支持了Neimark等和Messick等提出的将这类母血营养菌划归入支原体科、支原体属的建议。同时，根据测序得到的牛血巴尔通氏体16S rRNA基因序列，设计一对特异性引物，建立牛血巴尔通氏体病的PCR诊断方法。特异性试验和敏感性试验表明，该方法与猫血巴尔通氏体、奶牛附红细胞体、猪附红细胞体、牛伊氏锥虫、猫弓形虫无交叉反应，能检测到牛血巴尔通氏体阳性血样DNA最低浓度为36pg／μL。通过临床血样检测，证明该方法可以用于牛血巴尔通氏体病的诊断，为本病的分子流行病学调查、防制及病原学研究奠定了基础。