犬精原干细胞体外分离培养与EGFP基因转染的初步研究

论文摘要

背景和目的:精原干细胞具有自我更新的能力,是雄性动物体内唯一能进行遗传信息传递给后代的干细胞。因此,精原干细胞不但是研究精子发生、制作转基因动物和研究基因功能的重要资源,而且是对于保护濒临灭绝的野生动物有重要意义。自1994年小鼠精原干细胞首次移植成功,精原干细胞已经成为干细胞研究的热点。随后,精原干细胞移植技术在羊、牛、猪等动物上取得了较大的进展,为研究精原细胞的生理学方面特点和鉴定精原干细胞群建立了一个有效的方法。然而,犬精原干细胞的体外分离、培养及移植等技术尚无任何报道。本实验研究了犬精原干细胞的分离、纯化、培养及转染技术,初步建立了体外培养体系,为以后的移植技术奠定了基础并为精子的形成机制研究提供数据。方法:选取不同年龄段的犬进行睾丸HE染色的组织学观察,筛选合适月龄的毕格犬用于精原干细胞的研究。犬睾丸生精上皮细胞的分离采用了四种酶组合消化方法（胶原酶Ⅳ;胶原酶Ⅳ+胶原酶Ⅳ;胶原酶Ⅳ+胰蛋白酶;胶原酶Ⅳ+透明质酸酶+胰蛋白酶）,通过比较细胞活率（台盼蓝斥染法）和细胞总数,得出最优酶组合消化方法。根据睾丸支持细胞比精原细胞最先贴壁,可将精原细胞进行初步纯化,然后以DMEM为基础培养基分别添加不同浓度的血清（0%、1%、5%、10%和20%）或EGF（0 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、40 ng/ml、60 ng/ml和100 ng/ml）进行培养,通过计细胞集落数以检测对精原细胞生长情况的影响。采用阳离子聚合物和磷酸钙的转染方法,比较了质粒EGFP在精原干细胞培养72h后的表达情况。结果:犬睾丸内精原细胞的数量随日龄的增加而增多,但是6月龄的犬睾丸内精原细胞已有明显的分裂相,5月龄的犬睾丸内未见分裂相,但大多数精原细胞直径与6月龄的一致,4-4.5月龄的犬睾丸内精原细胞直径明显减小,而且精原细胞数量较多,本实验认为4-4.5月龄是用于犬精原干细胞分离研究的最佳年龄段。四种不同酶组合方法所得细胞总数（每100mg睾丸组织）分别为:3.37±0.101×106个、3.96±0.062×106个、4.35±0.110×106个和6.67±0.692×106个;细胞存活率分别为:82.4±1.94%、87.7±1.45%、89.7±0.88%和95.5±0.68%,胶原酶加胰蛋白酶的组合方法消化的效果最好（P<0.01）。经差速贴壁法纯化后精原干细胞的纯化率为50.86%,此法简单、易于操作,而且较好的保留了细胞的活力。在细胞培养体系的研究中发现,10%血清比其他浓度组更好的促进精原干细胞的生长。在含10%血清的DMEM中添加不同浓度的EGF,结果显示,20ng/mlEGF能极其显著的提高细胞集落数（P<0.01）。阳离子聚合物法和磷酸钙法对精原干细胞的转染率分别为22.14%和8.12%。结论:本实验首次建立了简单有效的分离犬睾丸生精上皮细胞的方法,获得了较多的细胞数和较好的存活率。犬精原干细胞在体外培养中可以存活1周并形成了细胞集落,表明此培养体系实现了精原干细胞的生长和增殖,但是精原干细胞的长期培养体系有待进一步研究。犬精原干细胞的分离、培养和转染的成功为下一步的移植奠定了基础。

论文目录

摘要

Abstract

符号说明

第一部分文献综述

1 精原干细胞形态特性

2 精原干细胞分离富集与鉴定

3 SSCs的体外培养体系

4 SSCs的移植

参考文献

第二部分研究论文

第一章犬睾丸生精上皮细胞悬液制备的研究

1 引言

2 材料与方法

3 结果

4 讨论

第二章犬精原干细胞体外培养与基因转染的研究