抑制素基因免疫对青脚麻鸡产蛋性能的影响及对卵巢促性腺激素受体mRNA表达的研究

论文摘要

家禽为卵生动物,性成熟的家禽没有发情周期、发情行为、妊娠期和哺乳期等典型的生理现象,只要条件适宜,在一段时间内卵泡可连续完成发育、排卵和受精等一系列过程,而且卵泡排卵后不形成黄体。禽类所特有的发育特点和结构特点,使其常被作为良好模型,在卵泡发育生物学的研究中广泛应用。本文应用免疫中和、基因克隆、RT-PCR等技术研究抑制素基因免疫对青脚麻鸡卵泡发育的作用及卵巢GTHR mRNA表达的影响。1.抑制素基因免疫对青脚麻鸡产蛋性能的影响为研究抑制素基因免疫对种鸡产蛋性能的影响,本试验以双拷贝抑制素与乙肝表面抗原基因融合表达质粒pcISI为疫苗免疫380日龄青脚麻鸡,并在此基础上,尝试了以减毒霍乱沙门氏菌为载体的重组抑制素疫苗。试验分为两个系列：系列1,以质粒pcISI进行免疫,包括5个随机分组（N=30）,T1-T3免疫剂量分别为125μg/300μl、75μg/300μl和25μg/300μl,T4在T3的基础上添加等质量的大肠杆菌基因组DNA作为佐剂,T5为空白对照,以等体积的生理盐水免疫。免疫前24h于相同部位注射0.5%盐酸普鲁卡因100μ1。间隔20d以等剂量进行加强免疫。系列2,以减毒沙门氏菌重组抑制素疫苗进行免疫,试验组（N=300）注射含抑制素重组质粒pXAIS的减毒沙门氏菌1010CFU/300μl,对照组（N=90）注射等量含空载体pVAX-asd的减毒沙门氏菌。试验的免疫周期均为50d。在整个免疫周期,记录产蛋量,每隔10d收集血清,检测血清中抑制素抗体水平,同时收集鸡蛋,检测鸡蛋品质及卵黄中抑制素抗体水平。免疫周期结束后,对卵巢进行解剖,统计各级卵泡数量。结果表明,抑制素重组质粒免疫能有效诱导产生抗体,并在一定程度上提高产蛋量,但免疫剂量与免疫佐剂的效果不显著；减毒重组疫苗虽然其能诱导产生相应的抗抑制素抗体,但对产蛋量的影响并不显著,其免疫条件有待于进一步探讨。此外,免疫对孵化率和蛋品质没有影响,表明各疫苗是安全的。2.青脚麻鸡FSHR和LHR基因的克隆及其mRNA在不同等级卵泡中的差异表达分析选择上述免疫周期结束时的青脚麻鸡,获取不同等级的卵泡。以各卵泡中的总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增鸡FSHR和LHR基因,以pMD19-T vector为载体,转化大肠杆菌E.coli DH5a,筛选阳性克隆并测序,用BLAST及DNAman软件分析比对同源性。采用优化的半定量RT-PCR技术,以鸡的β-actin为分子内参,比较研究不同等级卵泡在正常生理条件以及抑制素基因免疫后FSHR和LHR mRNA表达量的差异。结果测序得到了理论大小的鸡FSHR和LHR片段,并未发现有可变剪接形式的存在。半定量RT-PCR分析结果表明小黄卵泡（SYF）中FSHR和LHR mRNA的表达量均高于大白卵泡（LWF）；而在抑制素基因免疫后,FSHR mRNA在LWF中升高而在SYF中降低,LHR mRNA在免疫组的趋势却同FSHR mRNA相反。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（Abbreviation）
• 第一篇 文献综述
• 第一章 禽类卵泡的发育
• 1 禽类卵泡发育的特点
• 2 禽类卵泡发育成熟的调控机制
• 2.1 促性腺激素与卵泡的生长发育
• 2.2 抑制素与卵泡的生长发育
• 3 禽类卵泡发育和产蛋性能的关系
• 4 课题开展的目的和意义
• 参考文献
• 第二篇 实验研究
• 第二章 抑制素基因免疫对青脚麻鸡产蛋性能的影响
• 1 材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 所用质粒及菌株
• 1.3 试剂
• 1.4 仪器
• 2 方法
• 2.1 抑制素基因疫苗pcISI的大量制备与提纯
• 2.2 以减毒霍乱沙门氏菌为载体的抑制素基因疫苗的制备
• 2.3 试验设计
• 2.4 酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清和卵黄中抑制素抗体
• 2.5 卵泡发育检测
• 2.6 鸡蛋品质测定
• 2.7 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 pcISI质粒抽提鉴定
• 3.2 减毒重组疫苗免疫剂量的确定
• 3.3 抑制素基因免疫对抗体产生的影响
• 3.4 抑制素基因免疫对鸡产蛋率的影响
• 3.5 抑制素基因免疫对卵泡发育的影响
• 3.6 抑制素基因免疫对鸡蛋品质的影响
• 4 讨论
• 4.1 抑制素基因疫苗对抗体产生的影响
• 4.2 抑制素基因免疫对卵泡发育及产蛋性能的影响
• 4.3 抑制素基因免疫的安全性
• 5 结论
• 参考文献
• 第三章 青脚麻鸡FSHR LHR基因的克隆及其mRNA在不同等级卵泡中的差异表达分析
• 1 试验材料
• 1.1 试验动物
• 1.2 取材
• 1.3 主要试剂和仪器
• 1.4 试验仪器的准备
• 2 试验方法
• 2.1 总RNA的提取
• 2.2 RNA质量的鉴定
• 2.3 引物设计及RT-PCR
• 2.4 PCR产物的分析
• 2.5 FSHR LHR基因的克隆与鉴定
• 2.6 半定量RT-PCR体系的建立
• 2.7 FSH和LHR mRNA差异表达的检测
• 2.8 半定量数据的统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA的完整性及纯度检测
• 3.2 RT-PCR扩增产物的克隆测序
• 3.3 测序结果及序列分析
• 3.4 半定量RT-PCR反应体系的建立
• 3.5 卵巢中FSHR LHR mRNA表达的半定量检测结果
• 4 讨论
• 4.1 青脚麻鸡FSHR和LHR基因的克隆
• 4.2 青脚麻鸡GTHR mRNA在不同等级卵泡中的差异表达
• 4.3 抑制素基因免疫对不同等级卵泡中GTHR mRNA表达的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 硕士期间发表论文
• 作者简介
• 致谢