云南高黎贡山国家自然保护区土壤微生物多样性研究

论文摘要

土壤微生物是生态系统的重要成员,它参与生态系统的物质循环和能量流动,是土壤中最活跃的部分,它们在土壤中的数量与分布一定程度上反映出土壤肥力状况与植物营养的密切关系,同时也反映土壤、植被和气候等综合因素对土壤微生物的影响。因此土壤微生物多样性的保护和研究对系统生态保护具有重要意义。高黎贡山国家级自然保护区位于云南西部中缅边境地区,海拔760-3100m,具有高山、亚高山生物气候垂直带谱自然景观和异常丰富的生物多样性,是中国生物多样性保护具有全球意义的关键区域,被喻为“世界物种基因库”。研究高黎贡山土壤微生物群落结构与功能,揭示其生态分布和区域特异性,为评价高黎贡山地区的生态环境、了解全球变化对高黎贡山地区土壤微生物的影响以及高黎贡山自然保护区保护策略的制定提供科学依据。本研究采用传统分离培养方法对高黎贡山生物多样性固定监测样地的土壤中主要微生物类群的数量进行研究,探讨其与土壤酶和生态因子的相关性;采用木端限制性酶切片段长度多态性分析（T—RFLP）和基因芯片（GeoChipⅡ）等分子生物学技术对土壤细菌群落、氮循环相关基因（nifH和nosZ）、降解纤维素真菌及11类功能基因的多样性及分布特点进行研究。分离培养了土壤中高效降解纤维素真菌并对其进行分子鉴定。同时探讨了不同植被和海拔高度土壤微生物群落结构与功能的多样性及其主要影响因子。其主要研究结果如下:（1）对高黎贡山海拔960—2 878m的8个生物多样性固定监测样地的土壤微生物进行培养分析,所有样地中细菌数＞放线菌数＞真菌数,细菌、真菌、放线菌数量随海拔不同而变化,各样地间差异极显著（P＜0.05）,最高点均出现在海拔2 000m左右的森林样地;好气性纤维素菌和嫌气性纤维素分解菌在低海拔的灌丛和咖啡林数量丰富,而高海拔森林样地中数量相对较低,好气性自生固氮菌和嫌气性自生固氮菌数量在玉米地最高,咖啡林最低,纤维素菌和固氮菌数量在样地间均差异显著（P＜0.05）。土壤微生物量碳在玉米地、咖啡林和海拔2 000m的森林样地中偏高且所有样地间差异极显著（P＜0.01）。土壤微生物随海拔高度变化且与土壤酶及生态因子呈现不同程度的相关性。细菌数、总菌数、微生物量碳分别与脲酶和淀粉酶活显著相关（P＜0.05）;真菌数与淀粉酶活显著相关（P＜0.05）;嫌气固氮菌与脲酶、蛋白酶、淀粉酶活都显著相关（P＜0.05）。细菌数、微生物总数与土壤有机质含量显著相关（P＜0.05）,放线菌数与全氮、全磷、全钾、海拔、含水量、pH值及温度显著相关（P＜0.05）;纤维素菌与温度、海拔、含水量显著相关（P＜0.05）;好气固氮菌与全磷显著相关（P＜0.05）,嫌气固氮菌与有机质、全氮、全磷及含水量显著相关（P＜0.05）;微生物量碳与有机质含量显著相关（P＜0.05）。说明影响高黎贡山土壤微生物数量和多样性垂直分布的主要生态因子是土壤酶、温度、有机质、含水量。人为耕作活动和土地利用方式的改变、植被类型等因素对微生物量有重要影响,且这种影响具有综合效应。（2）本研究首次采用核糖体DNA基因文库技术与T-RFLP技术相结合,分析高黎贡山8个不同海拔和植被类型的生物多样性固定监测样地中土壤细菌16S rDNA基因多样性。8个样地Msp I酶切共得到289个OTU,Rsa I酶得到216个OTU。基于Msp I酶切指纹图谱:海拔2 000m左右的森林土壤细菌多样性普遍高于其它海拔和植被的样地,样地内细菌多样性与可培养微生物数量显著相关。16S rDNA文库随机测序150个阳性克隆得到132条特异序列,它们分属细菌的7个门,其中酸杆菌门占总鉴定数的57%,为高黎贡山地区土壤细菌的优势菌群。土地利用方式的不同和温度是影响此地区土壤细菌多样性的主要因素。地理距离和植被类型的差异是影响此地区土壤细菌生态分布的主要因素。此外,土壤pH值可能对群落结构起重要作用,而其它生态因子均与土壤细菌群落结构多样性及生态分布有一定相关。（3）为了解高黎贡山地区土壤氮循环微生物的群落结构及其差异,利用T-RFLP技术对高黎贡山地区土壤微生物固氮酶基因nifH和反硝酶基因nosZ多样性及生态分布进行研究,研究选取了来自于不同海拔高度、植被类型的8个生物多样性固定监测样地。利用4种限制性内切酶（HaeⅢ、HhaⅠ、#saⅠ和MspⅠ）分别对这两个基因进行T—RFLP分析,两个基因均是用HhaⅠ酶切得到OTU数最多:8个样地共得到63个nifH基因OTU,156个nosZ基因OTU。样地内nifH基因多样性为0.454（样地10）—1.200（样地5）,各样地均有3—4个优势菌群,nifH基因多样性与土壤pH值相关性较高,与其它生态因子有不同程度相关,受到土壤耕作制度、植被类型等诸多因素的影响;样地内nosZ基因多样性为0.760（样地10）—1.464（样地13）,各样地均有2—4个优势菌群,nosZ基因多样性与温度、海拔、pH值、土壤含水量有较强相关。地理距离和植被类型对nifH和nosZ基因的分布有重要影响。（4）采用刚果红平板和PDA平板对研究样地土壤中降解纤维素类真菌进行分离培养,通过液体发酵测定其纤维素酶活差异,筛选相对酶活较高的菌株进行形态学和分子生物学鉴定,共得到35株具有较高纤维素酶活真菌,其96h液体发酵测量CMC酶活力范围在79.6（菌株6）-228.9IU（菌株3）。这些株菌分属15个属,其中4株归属于担子菌类（Basidiomycetes）的3个属,占筛选菌株数的11.4%,31株归属于子囊菌类（Ascomycetes）12个属,占筛选菌株数的88.6%。其中曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、葡萄状穗霉属（Sttachybotrys）、毛壳霉属（Chaetomium）的真菌共计20株,占总分离菌株数的57.1%,是高黎贡山土壤中降解纤维素类真菌的优势菌群。其中菌株3被鉴定为扩展青霉,其在酶系和对底物利用都有突出特点,具有开发前景。（5）利用功能基因芯片（GeoChipⅡ）检测高黎贡山高黎贡山海拔960—2 878m的6个样地土壤微生物与碳、氮、磷、硫、磷循环、金属抗性,生物降解相关的11类功能基因。6个样地共检出功能基因1 515个及未知基因27个,各类功能基因检出数:ORG＞MET＞CDEG＞NRED＞NIT＞DSR＞methane ox＞CFIX＞NFIX＞methane gen＞PER。样地检出功能基因数目及多样性:样地5＞样地10＞样地7＞样地13＞样地15＞样地8;土壤微生物功能基因多样性受人为干扰,植被类型、海拔、土壤生态因子等多方面因素共同影响,其中人为干扰和植被类型的变化明显改变了土壤微生物功能群。重点分析了高黎贡山6个样地土壤微生物与碳、氮循环相关的7类基因:CDEG、CFIX、methane ox、methane gen、NFIX、NIT、NRED。这些基因在各样地检出数、多样性和均匀度均不相同,并且同一类基因在各样地的检出情况也互不相同。碳氮循环基因多样性与土壤有机质、全氮、碳氮比、速效磷和土壤含水量等生态因子有不同程度的相关。不同强度的人为干扰和不同的植被类型,对土壤微生物碳氮循环基因种类与分布有显著差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 第一节 土壤微生物多样性
• 1 土壤微生物多样性研究的意义
• 2 土壤微生物多样性常用指标
• 3 土壤微生物多样性研究的常用方法
• 4 土壤微生物群落结构与功能多样性
• 5 环境变化对土壤微生物的影响
• 第二节 T—RFLP技术及其在环境微生物研究中的应用
• 1 T-RFLP技术及其在环境微生物研究中的优势
• 2 T—RFLP技术的基本原理和步骤
• 3 T—RFLP在环境微生物研究中的应用
• 第三节 基因芯片技术及其在环境微生物研究中的应用
• 1 基因芯片技术简介
• 2 基因芯片基本操作
• 3 基因芯片技术在环境微生物研究中的应用
• 4 基因芯片在土壤微生物研究中的优势与面临的挑战
• 5 解决方法与发展方向
• 第四节 本研究的背景、目的、意义和主要内容
• 1 本研究的背景、目的和意义
• 2 本研究的主要内容
• 第二章 高黎贡山土壤微生物群落结构与生态因子相关性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 土壤微生物群落与微生物量碳测定结果
• 2.2 土壤酶活性测定结果
• 2.3 土壤生态因子测定结果
• 2.4 土壤微生物与土壤酶、土壤生态因子相关性
• 2.5 土壤生物地理化学性状的主成分分析结果
• 3 讨论与结论
• 第三章 高黎贡山土壤细菌分子多样性研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 样品总DNA提取和16S rRNA基因扩增结果
• 2.2 T-RFLP酶切图谱分析结果
• 2.3 8个样地的细菌的群落结构组成
• 2.4 细菌多样性分析及与生态因子的相关性分析
• 2.5 样地间T—RFLP图谱的相似性分析与聚类结果
• 2.6 16S rDNA测序结果及系统发育分析
• 3 讨论与结论
• 第四章 高黎贡山土壤氮循环微生物多样性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 带荧光标记的固氮菌和反硝化菌扩增结果
• 2.2 酶切图谱分析结果
• 2.3 反硝化菌和固氮菌的群落结构
• 2.4 样地内nosZ和nifH基因多样性分析
• 2.5 样地间nosZ基因和nifH基因的多样性分析
• 2.6 固氮菌群和反硝化菌群落结构多样性与生态因子相关性分析结果
• 3 讨论与结论
• 第五章 高黎贡山土壤中可培养的降解纤维素真菌（CCDF）多样性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 CCDF的分离与纯化
• 2.2 CCDF的酶活力和生长性状的检测
• 2.3 CCDF的系统发育分析结果
• 2.4 CCDF的多样性分析与样地聚类分析
• 3 讨论与结论
• 第六章 利用基因芯片技术研究高黎贡山土壤微生物功能基因多样性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 土壤微生物功能基因检出结果
• 2.2 样地内微生物功能基因多样性分析结果
• 2.3 样地间微生物功能基因多样性分析结果
• 2.4 6个样地分级聚类分析
• 2.5 6个样地的主成分分析（PCA）
• 2.6 碳、氮循环功能基因多样性分析结果
• 3 讨论与结论
• 3.1 影响功能基因多样性的因素
• 3.2 碳氮循环功能基因多样性及其影响因素
• 3.3 芯片检测的灵敏度与特异性
• 3.4 基因芯片检测与其它技术联合使用
• 第七章 结论
• 本研究的特色与创新
• 参考文献
• 附表A
• 附表B
• 附表C
• 英文缩写与主要符号表
• 致谢
• 作者简介