精制清开灵注射液对脑缺血的治疗作用及对兴奋性毒性级联损伤的调控机制

论文摘要

缺血性中风是严重威胁人类生存健康的疾病之一,具有高发病率、高致残率、高致死率。缺血性中风病急性期治疗对预后影响重大,也是国内外研究的热点和难点。本课题旨在研究复方中药精制清开灵（JZQKL）注射液的抗脑缺血作用,并系统阐释其对脑缺血后兴奋性毒性级联损伤的综合调控机制,揭示其抗兴奋性毒性的部分分子靶点。中医药在缺血性中风急性期治疗中发挥了重要作用。中医认为,热毒是缺血性中风的重要致病因素之一,清热解毒法是治疗缺血性中风的有效治法之一。本研究进行一项纳入39项随机对照临床试验的Meta分析发现,清热解毒治法指导下的中药治疗急性缺血性中风,疗效与对照组相比有显著优势。故本课题选择清热解毒的代表中药——清开灵注射液进行研究。然而清开灵目前面临着不良事件发生率高的重要问题,限制了临床应用。基于此,本课题组提出了“部分替代、局部优化、质量可控、疗效提高”的策略,在清开灵基础上优化处方,研制出精制清开灵（JZQKL）。本课题对JZQKL进行了处方优化,进一步确定了其处方配比。JZQKL是在采用中药有效成分进行配伍组方的新型复方中药,它具有如下突出优势：其一,增强了质量可控性,提高了药物安全性；其二,JZQKL仍具备复方中药多靶点作用的优势；而且,其组方成分明确,更容易与现代药理学进展接轨。对脑缺血损伤机制的研究表明,兴奋性毒性是脑缺血病理机制的关键始动环节。脑缺血后,由于能量耗竭和胞膜去极化,会引起以谷氨酸为主的兴奋性氨基酸的快速过量释放,引起NMDA受体过度激活,导致钙超载和氧化应激,二者又会造成内质网应激,最终启动凋亡通路。多年来,针对上述机制研发了大量药物,如NMDA受体阻断剂,钙离子拮抗剂,抗氧化剂等,但尚无一种药物被证实临床有效。基于上述基础,我们分析认为：其一,脑缺血发病机制非常复杂,相互关联,单独针对单一分子靶点很难取得很好疗效,多靶点调控应是脑缺血治疗的更有效策略；其二,通过宏观辨证和微观分析,我们发现,在缺血性中风急性期,兴奋性毒性损伤与中医毒邪致病有较强的相关性。那么清热解毒复方JZQKL是否可以多靶点调控兴奋性毒性损伤机制呢?王永炎院士指出“中医药研究只有在整体论、系统论、理性论指导下才能更好阐发其原创优势。”围绕上述问题,在系统生物学策略的指导下针对脑缺血后的兴奋性毒性相关机制的整体性和动态性变化,评价JZQKL整体效应和多靶点干预作用,从而阐释其抗脑缺血和调控兴奋性毒性的分子机制。研究内容分为3部分：一、JZQKL治疗脑缺血的药效学研究,首先比较并选择了神经功能评分标准；然后对JZQKL进行了处方筛选,确定了处方；分别采用永久性局灶脑缺血、局灶脑缺血再灌及全脑缺血模型,系统评价JZQKL的抗脑缺血作用；并进一步探讨了JZQKL对脑缺血的治疗时间窗。二、JZQKL对脑缺血后兴奋性毒性级联损伤的调控机制,围绕脑缺血后兴奋性毒性级联损伤机制,针对谷氨酸异常释放、钙超载、氧化应激、内质网应激及细胞凋亡等具体机制展开研究,以期阐明JZQKL注射液对兴奋性毒性级联损伤的多层次多角度干预作用。三、JZQKL干预兴奋性毒性介导氧化应激的分子靶点探讨,针对NR2B-PSD95-nNOS蛋白间相互作用依赖的nNOS激活和NADPH氧化酶激活这两个分子靶点进行了深入研究,以探讨JZQKL抗氧化应激的具体靶点,为全面揭示JZQKL对脑缺血后兴奋性毒性的多靶点调控机制提供依据。实验结果和结论如下：1、JZQKL注射液是一种具有较长治疗时间窗的抗脑缺血药物本研究采用多种动物模型综合评价JZQKL抗脑缺血药效,结局评价重视组织学病灶与神经功能评分相结合。首先,比较了几种国内外常见的神经损伤评分表,以选择更适合的神经功能药效指标。结果发现与国内常用的Bederson评分相比较,Julio H评分和Clark局灶性功能损伤评分与脑梗塞体积相关性更高,更准确地反映神经损伤程度,故选用其作为药效指标；采用两种局灶脑缺血模型,pMCAO和tMCAO大鼠,分别给予JZQKL注射液6、3、1.5ml/Kg治疗,以清开灵注射液3ml/Kg作为阳性对照,结果发现各给药组均具有明显的治疗作用,可显著减小脑梗死体积并改善神经功能评分,且JZQKL存在一定剂量依赖性；同样,JZQKL各剂量组对小鼠全脑缺血再灌模型（BCCAO）也表现出显著治疗作用,可减少神经细胞死亡和尼氏体的脱失；在明确JZQKL抗脑缺血药效后,继续探索其治疗时间窗,分别在脑缺血后1.5、3、6、9h给药,发现6h内给药均可显著减小梗死体积并改善神经功能,说明JZQKL治疗时间窗可达6h。具有一定的治疗时间窗是抗脑缺血药物的重要优势,也为其临床应用提供了有力依据。2、JZQKL对脑缺血后兴奋性毒性级联损伤具有综合调控作用针对兴奋性毒性级联损伤的不同环节进行研究发现,JZQKL对其具有多层次的综合调控作用。JZQKL可以显著降低MCAO大鼠脑微透析液中的Glu含量,说明其有抑制脑缺血后Glu异常释放的作用；JZQKL可以降低脑缺血2h后神经细胞内Ca2+含量,提示其具有抑制脑缺血后神经细胞钙超载的作用；JZQKL对MCAO小鼠缺血24h后脑内ROS含量、MDA含量具有显著降低的作用,并可增加SOD含量,证实其具有明显的抗氧化应激作用；JZQKL可抑制MCAO小鼠脑匀浆中caspasel2的激活,并下调P-elF2a表达,提示其具有显著的抗内质网应激作用；JZQKL可减少TUNEL染色中荧光阳性细胞数,表明其具有明显的抗神经细胞凋亡作用。3、通过干预PSD95-nNOS蛋白间相互作用下调nNOS激活和抑制NADPH氧化酶激活是JZQKL的具体分子靶点近年来发现,NR2B-PSD95-nNOS蛋白间相互作用是兴奋性毒性介导nNOS激活生成一氧化氮的关键分子机制。我们采用免疫共沉淀的方法分析PSD95-nNOS蛋白间相互作用发现,脑缺血1.5h再灌0.5h后,患侧前额皮层组织中nNOS:PSD95显著上调,说明PSD95-nNOS蛋白间相互作用增强；JZQKL给药组nNOS:PSD95较模型组显著下调,表明JZQKL可抑制PSD95-nNOS蛋白间相互作用。2009年Brennan等在Nature Neuroscience上发文证实NADPH氧化酶是NMDA受体介导的超氧阴离子生成的关键机制。本实验表明,MCAO小鼠缺血1.5h再灌22.5h后,脑组织中NADPH氧化酶活性显著上调,其激活状态蛋白NOX2在海马和皮层区的表达显著增加；JZQKL治疗组NADPH氧化酶活性和NOX2表达水平较模型组均显著下降,说明JZQKL可抑制脑缺血后NADPH氧化酶的过度激活。可见,JZQKL可通过干预上述两个分子靶点,抑制兴奋性毒性介导的氧化应激损伤。另外,本实验发现JZQKL对脑缺血后nNOS磷酸化具有上调作用。nNOS磷酸化是脑缺血后机体抑制nNOS过度激活的代偿性机制,其在磷酸化状态不会被兴奋性毒性激活。JZQKL的这一作用很可能是其抑制nNOS激活的另一靶点,有待进一步深入研究。概括上述结论,本课题在系统生物学策略的指导下,从整体、动态的角度,对有效成分配伍小复方JZQKL进行了多层次、多角度的研究。结果表明了JZQKL具有显著的抗脑缺血作用,且具备一定的治疗时间窗；揭示了JZQKL对兴奋性毒性级联损伤机制具有综合调控作用；发现了JZQKL抗兴奋性毒性的两个分子靶点——NADPH氧化酶和PSD95-nNOS相互作用。上述结论有力地支持了我们立题之初的设想,具有清热解毒作用的中药复方JZQKL,确实对兴奋性毒性级联损伤机制具有多靶点的调控作用,而且对脑缺血有显著的治疗作用。这启示我们,对待中药复方治疗现代疾病的研究,既要坚持在中医药指导思想下进行分析,重视整体观念,又要深入认识现代疾病的病理生物基础,跟踪最新研究进展,并在系统生物学策略的指导下对上述两方面进行有机整合,从而凝炼出科学设想,采用实验进行研究,这将为研究中药复方科学内涵提供一个新思路。总之,本文对JZQKL的研究是在系统生物学策略指导下,将JZQKL的中医药特色与现代药理最新进展相结合,阐明了JZQKL抗脑缺血后兴奋性毒性级联损伤的综合调控机制,在分子水平上揭示了JZQKL的部分作用靶点,为全面认识JZQKL抗脑缺血作用的科学内涵奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩略词
• 文献综述
• 综述一 清热解毒法治疗急性缺血性中风的系统综述
• 参考文献
• 综述二 脑缺血病理机制与治疗策略及清开灵干预靶点的研究进展
• 参考文献
• 综述三 神经功能损伤评分在大鼠脑缺血实验中的应用
• 参考文献
• 理论研究
• 理论研究一 试析清热解毒活血法是缺血性中风病急性期的重要治法
• 参考文献
• 理论研究二 浅谈名优中药二次开发的思路和途径
• 参考文献
• 实验研究
• 前言
• 技术路线图
• 第一部分 JZQKL注射液治疗脑缺血的药效学研究
• 实验一 三种神经功能评分在鼠类局灶性脑缺血模型评价中的比较
• 实验二 JZQKL注射液的处方筛选试验
• 实验三 JZQKL注射液对大鼠永久性局灶脑缺血（pMCAO）和局灶脑缺血再灌（tMCAO）模型的干预作用
• 实验四 JZQKL对小鼠全脑缺血再灌模型（BCCAO）的干预作用
• 实验五 JZQKL注射液治疗脑缺血的时间窗研究
• 第二部分 JZQKL注射液对脑缺血后兴奋性毒性级联损伤的调控机制
• 实验一 JZQKL注射液对脑缺血后大鼠脑微透析液中G1u含量的影响
• 实验二 JZQKL注射液对MCAO小鼠神经元钙超载的干预作用
• 实验三 JZQKL注射液对脑缺血后氧化应激的干预作用
• 实验四 JZQKL注射液对脑缺血后内质网应激和神经元凋亡的干预作用
• 第三部分 JZQKL注射液干预兴奋性毒性介导氧化应激的分子靶点探讨
• 实验一 JZQKL对NR2B-PSD95-nNOS蛋白间相互作用的干预
• 实验二 JZQKL注射液对脑缺血后NADPH氧化酶的调控作用
• 结语
• 创新点
• 致谢
• 个人简历
• 附图