精核解聚影响猪卵胞质内单精子注射（ICSI）效果研究

论文摘要

卵胞质内单精子注射（ICSI）的出现为治疗人类男性不育提供了新的途径。作为一种家畜胚胎工程新技术,ICSI可以解决猪的多精受精问题,但是由于该技术是直接把精子注入卵胞质内,省去了精子在穿过透明带和卵质膜等过程中所发生的生理和生化反应,同时,精子注射过程对卵母细胞具有提前弱性激活作用并使受体卵胞质内成熟促进因子（MPF）活性提前下降,如果精子未经适当的预处理,加上胞质成熟或活化程度不够,将影响精核在卵胞质内的解聚过程,从而影响ICSI效果,如果采取的促使精核解聚方法不当,还会引起卵母细胞孤雌发育率的增加。本实验旨在通过探索促进精核解聚的适宜方法,提高猪ICSI的效率。 本实验首先检测了猪精子ICSI后精子形态变化及原核形成情况,进而研究不同精核解聚方法,包括注射卵母细胞激活、二硫苏糖醇（DTT）和谷胱甘肽（GSH）·预处理精子、表皮生长因子（EGF）和半胱氨酸（Cys）预处理卵母细胞对ICSI后精核解聚、原核形成和发育以及胚胎体外发育效果的影响。研究结果如下: 试验1:猪精子ICSI后原核形成时序研究。采用猪精子进行ICSI,分别于注射后不同时间（6h,9h,12h,15h和18h）通过荧光染色观察:ICSI精子的形态变化及原核的形成情况。研究发现精核解聚主要集中在ICSI后9-12小时,解聚率为35.4%-43.7%。雌雄原核形成时间间隔较大,ICSI后9h未见雄原核,直到ICSI后12h,才有5.4%精子形成雄原核,而ICSI后9h就有20.0%卵母细胞形成雌原核。相同时间的雄原核形成率明显低于雌原核形成率,雌雄原核在ICSI后9h、12h,15h和18h分别为20.0% vs 0%、46.2% vs 5.4%、63.5% vs 25.5%和70.3% vs 39.1%。结臬表明ICSI后,猪精核在卵胞质中较难解聚,雄原核的出现晚于雌原核大约3h,雌雄原核呈现不同步发育。 试验2:不同激活方法对猪精子ICSI效果的影响。本试验以三种不同注射方式即精子注射、假性注射和不注射结合三种不同人工激活方法即注射CaCl2溶液（1.8pl,30mM）、离子霉素（15μmol/L,40min）和电脉冲（场强0.4KV/cm、脉冲时程90μs、一次脉冲）处理卵母细胞,以至少形成一个原核或发生卵裂计为激活,形成雌雄原核计为受精,在无精子注射的情况下至少形成两个原核或发生卵裂计为孤雌发育,统计分析不同激活方法对ICSI效果的影响。（1）机械刺激:研究发现假性注射+未激活处理组卵母细胞的激活率虽然高于无机械刺激+无激活处理对照组[（12.8%～13.3%）vs（8.3%～8.9%）],但明显低于假性注射+人工激活处理组[（12.8%～13.3%）vs（18.3%～64.3%）],结果表明,单纯注射性机械刺激对猪卵母细胞的激活效果较差,为提高卵母细胞激活率,有必要进行人工激活。（2）人工激活:精子注射卵母细胞经CaCl2、离子霉素和电脉冲激活处理后,其激活率无显著性差异（69.4% vs 67.3% vs 70.4%）,CaCl2处理组的受精率显著高于离子霉素处理组（46.4% vs 31.2%）（P<0.05）,并与电激活处理组无显著性差异（46.4% vs 38.8%）（P>0.05）。但是,在

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 1.动物的自然受精
• 2.ICSI的研究历史
• 3.猪ICSI研究
• 4.ICSI的操作程序
• 4.1 卵子的收集和处理
• 4.2 精子或精核的准备
• 4.3 精子或精核的显微注射
• 4.4 注射卵的激活
• 4.5 ICSI受精卵的培养
• 5.影响ICSI的关键因素
• 5.1 精子状态
• 5.2 卵子状态
• 5.3 种属特异性
• 5.4 注射卵的激活
• 5.5 显微操作技术
• 6.ICSI的应用前景
• 6.1 提高珍贵动物配子的利用率，扩大配子的利用范围
• 6.2 提高体外成熟卵母细胞的受精率
• 6.3 性别选择
• 6.4 治疗雄性不育
• 6.5 简化转基因的方法
• 6.6 应用于生殖和发育机制的基础研究
• 7.ICSI技术存在的问题
• 7.1 总体效率低
• 7.2 ICSI的单性生殖现象
• 7.3 ICSI精子的选择与遗传
• 7.4 设备昂贵、操作复杂、成本较高，不利于生产推广
• 引言
• 1.材料与方法
• 1.1 药品、试剂与仪器设备
• 1.1.1 药品与试剂
• 1.1.2 仪器设备
• 1.2 试剂的配制
• 1.3 显微工具制备
• 1.4 方法
• 1.4.1 卵母细胞的采集与体外成熟
• 1.4.2 卵母细胞和精子的准备
• 1.4.3 卵胞质内精子显微注射
• 1.4.4 注射卵母细胞的激活处理
• 1.4.5 ICSI卵母细胞早期胚胎培养及发育潜力的评定
• 1.4.6 试验设计
• 1.4.7 统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 ICSI后精子形态学变化规律和原核形成类型的检测
• 2.2 ICSI卵原核形成类型的检测
• 2.3 不同激活方法对猪ICSI效果的影响
• 2.4 不同浓度DTT预处理精子后精子形态学的变化
• 2.5 不同浓度DTT预处理精子对原核形成和胚胎体外发育效果的影响
• 2.6 GSH对猪精子ICSI效果的影响
• 2.7 卵母细胞成熟培养液中添加Cys和EGF对猪ICSI效果的影响
• 3.讨论
• 3.1 ICSI后精子早期形态学和原核形成变化规律
• 3.2 注射后激活处理对ICSI效果的影响
• 3.3 DTT处理精子对ICSI效果的影响
• 3.4 GSH处理精子对ICSI效果的影响
• 3.5 卵母细胞成熟培养液中添加Cys和EGF对猪ICSI效果的影响
• 4.结论
• 参考文献
• 附录1：缩略词表
• 附录2：图版说明
• 致谢
• 发表文章及参加课题一览表