贵州3种马铃薯病毒的DAS-ELISA检测及分子鉴定

论文摘要

马铃薯是一种重要的全球性的经济作物，马铃薯病毒病是影响马铃薯生产的重要因子，马铃薯病毒是引起马铃薯退化的根本原因。马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV）是严重危害我国马铃薯产量的三种主要病毒。本研究从贵州省六县一市的马铃薯种植区，对不同马铃薯品种的3种马铃薯病毒的发生症状进行了调查，并对采集的202份相关样品进行了双抗体夹心酶联免疫吸附测定（Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay，DAS-ELISA）的检测技术的研究，从而建立了一套完整的酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测PVX、PVY和PLRV程序。根据PVX、PVY和PLRV的外壳蛋白基因序列，分别设计合成了三对特异性引物。分别从DAS-ELISA检测的感染马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒为阳性的马铃薯叶片为试材，对马铃薯Y病毒采取反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase chain reaction，RT-PCR）和免疫捕获反转录聚合酶链式反应（Immunocapture RT-PCR，IC-RT-PCR）方法对PVY进行了分子鉴定，测序得到两条PVY外壳蛋白（coat protein，CP）基因序列，长度为804 bp。通过和其它己知PVY分离物CP基因序列的同源性比较和氨基酸序列差异性分析，并建立了PVY CP核苷酸序列的系统发育树及其类型的分析，序列已经登录了NCBI（GenBank登录号分别为EF063710与EF063712）。用IC-RT-PCR方法对PVX、PLRV进行了分子鉴定，测序得到两条PVX CP与PLRV CP基因序列，长度分别为714 bp和627bp，通过和其它已知分离物CP基因序列的同源性比较和氨基酸序列差异性分析，并建立了PVX CP、PLRV CP核苷酸序列的系统发育树及其类型的分析，序列己经登录了National Center for Biotechnology Information（NCBI），获得GenBank登录号分别为EF063709与EF063711。本文报道了三种简捷、快速、灵敏、可靠的马铃薯病毒的检测技术：ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术。ELISA可在不需提纯病毒RNA的情况下实现对病毒的检测，较RT-PCR检测技术快速、简捷，更适合于大量样品的检测。IC-RT-PCR检测技术与RT-PCR检测技术相比省去了病毒RNA的提取这一烦琐步骤，操作更简单，灵敏度与RT-PCR基本相同，而RT-PCR与IC-RT-PCR检测技术较ELISA检测技术特异性更强。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 一、马铃薯是重要的农作物
• 二、马铃薯病毒病与马铃薯病毒性病害的研究概况
• 1 马铃薯病毒病与马铃薯病毒性病害
• 2 马铃薯主要病毒简介
• 2.1 马铃薯X病毒（PVX）
• 2.2 马铃薯Y病毒（PVY）
• 2.3 马铃薯卷叶病毒（PLRV）
• 三、马铃薯病毒检测方法
• 1 电镜技术方法
• 2 以抗体为基础的免疫学检测方法
• 3 分子生物学方法检测技术
• 3.1 RT-PCR检测技术
• 3.2 核酸杂交技术
• 3.3 指示分子核酸斑点杂交技术
• 4 马铃薯病毒检测方法讨论与前景
• 四、本研究的目的、意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 反应与测序引物
• 1.3 试剂
• 1.4 缓冲液的配制
• 1.5 仪器
• 2.方法
• 2.1 贵州3种马铃薯病毒病发生情况调查
• 2.1.1 病害调查与样品采集
• 2.1.2 病毒样品的DAS-ELISA检测的操作步骤
• 2.2 植物总RNA的提取
• 2.2.1 DEPC水、器具和容器的处理
• 2.2.2 马铃薯叶片总RNA的提取（Trizol提取液法）
• 2.2.3 RNA的分析和定量
• 2.3 RT-PCR反应
• 2.3.1 cDNA第一链合成
• 2.3.2 普通PCR反应
• 2.4 免疫捕获反转录PCR（Immunocapture RT-PCR,IC-RT-PCR）
• 2.4.1 试剂的配制
• 2.4.2 IC-RT-PCR操作步骤
• 2.5 PCR产物纯化
• 2.6 核苷酸序列测定与分析
• 第三章 贵州3种马铃薯病毒DAS-ELISA检测及分子鉴定
• 1.贵州3种马铃薯病毒DAS-ELISA检测
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 3种马铃薯病毒在贵州田间的主要表现症状
• 1.3.2 3种马铃薯病毒在贵州几个种植区的分布情况
• 1.3.3 3种马铃薯病毒的地理分布
• 1.3.4 3种马铃薯病毒与种薯品种来源关系
• 2.3种马铃薯病毒的分子鉴定
• 2.1 马铃薯Y病毒的分子鉴定
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.3.1 RNA的提取结果
• 2.1.3.2 PVY CP的RT-PCR扩增
• 2.1.3.3 PVY CP的IC-RT-PCR扩增
• 2.1.3.4 PVY CP序列的测定与分析
• 2.1.3.5 PVY不同分离物CP序列的同源性比较及分析
• 2.2 马铃薯X病毒的分子鉴定
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.3.1 PVX CP IC-RT-PCR扩增
• 2.2.3.2 PVX CP序列的测定与分析
• 2.2.3.3 PVX不同分离物CP序列的同源性比较及分析
• 2.3 马铃薯卷叶病毒的分子鉴定
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.3.1 PLRV CP IC-RT-PCR扩增
• 2.3.3.2 PLRV CP序列的测定与分析
• 2.3.3.3 PLRV不同分离物CP序列的同源性比较及分析
• 第四章 讨论与结论
• 1 讨论
• 1.1 3种马铃薯病毒的调查检测与分析
• 1.2 RT-PCR与IC-RT-PCR两种方法的比较
• 1.3 DNA测序技术与系统进化树
• 2 结论
• 2.1 3种马铃薯病毒的DAS-ELISA检测
• 2.2 PVY、PVX与PLRV的分子鉴定及分子变异分析
• 2.3 基因序列登录
• 2.4 进行了三种检测方法的比较
• 2.5 优化IC-RT-PCR检测技术条件
• 致谢
• 参考文献
• 附录1.发表文章及参加学术交流情况
• 附录2:论文所用缩写及中英文对照
• 图版