论文摘要
研究背景和目的肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC,简称肝癌）是我国最常见的高发肿瘤之一,其发生发展是由体内多基因参与、多步骤协同的复杂过程。P28GANK是在2000年克隆的肝癌相关基因,在肝癌的发生及发展中起着重要作用,已被公认为已知的唯一一个具有肝癌特异性的癌蛋白。前期研究已证实此基因在正常组织内不表达,肝硬化组织内低表达,肝癌组织内高表达。我们实验室的前期研究表明P28GANK在促进细胞增殖及抑制细胞凋亡中起着相当重要的作用（Gastroenterology,2005）。但P28GANK通过哪些信号转导通路执行癌蛋白样作用,围绕P28GANK相关凋控网络是如何作用,有哪些与其相互作用蛋白参与还有待于进一步研究解决,阐明上述问题,不仪是弄清P28GANK功能和作用机制的关键之一,也将有助于全面系统解析肝癌发生发展的分子机理。目前,揭示蛋白质间的相互作用以及研究蛋白信号转导网络,构建蛋白质相互作用关系图谱已成为蛋白质组学研究的热点,相关技术正在迅速完善和发展。常用的分离蛋白质技术有双向电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）,差异凝胶电泳（diference gel electrophoresis,DIGE）,同位素亲和标签（isotopecoded-affinity tags,ICAT）技术等,它们与质谱（mass spectrometry）技术联用使我们能够鉴定分析微量蛋白。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags forrelative and absolute quantitation,iTRAQ）技术作为一种新的能够进行绝对和相对定量的技术,具有良好的精确性和可重复性,弥补了传统技术的不足。其优点为:1、可以同时对最多四种不同样本中的蛋白质进行定量比较,因此可以对正常与疾病、治疗前后、疾病发展过程、细胞培养的不同状态下蛋白质表达质和量的变化进行研究:2、由于iTRAQ试剂可以与每个蛋白的多个氨基及侧链氨基酸进行标记,因此几乎样本中的所有蛋白都可以标记,而且可以对膜蛋白、疏水蛋白等DIGE技术不能检测的蛋白进行标记:3、iTRAQ试剂可以标记修饰后的氨基酸,因此可以对磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻译后修饰（post-translational modifications,PTMs）蛋白进行定量、定性研究:4、iTRAQ试剂的报告离子为小分子物质,因此在质谱图中很容易与其它肽片段离子区分,保证了定量的准确性:它已成为研究蛋白质组学的一个有效工具,随着该技术的不断完善,它在认识蛋白质相互作用的过程中必将发挥越来越重要的作用。本研究运用腺病毒介导的RNA干扰技术与iTRAQ技术相结合鉴定肝癌癌蛋白p28GANK的下游调控蛋白,并观察此过程中各种蛋白含量的动态改变,目的是研究与p28GANK相关的信号调控网络,并探讨其在肿瘤基因治疗方面潜在的应用价值。实验方法:1.选用高表达p28GANK的肝癌细胞系HepG2,运用RT-PCR和Western blot验证腺病毒载体介导的siRNA下调P28GANK表达;2.TUNEL实验和DAPI染色反映干扰P28GANK对肝癌细胞凋亡影响;3.选取HepG2细胞系为研究对象,在体外干扰P28GANK引发的凋亡,获取干扰0小时,48小时,72小时的蛋白样本,运用iTRAQ技术标记蛋白,MS/MS质谱鉴定蛋白并进行相对定量分析;4.通过Western Blot及RT-PCR技术验证iTRAQ鉴定的部分差异蛋白;5.通过Western Blot实验在肝癌及癌旁组织中观察差异蛋白的表达;6.Western Blot技术反向验证差异蛋白在P28GANK过表达细胞系（293T细胞稳定转染p28GNNK）的表达。结果:1.肝癌细胞系RT-PCR和Western blot验证腺病毒载体介导的siRNA下调P28GANK表达可行;2.TUNEL实验和DAPI染色显示干扰P28GANK引发了肝癌细胞凋亡;3.iTRAQ试验共成功检测出了近700个蛋白,其中436个蛋白（＞1.5倍或＜0.62倍）在凋亡过程中有显著量的改变,我们对其中8个进行了Western-blot和RT-PCR验证;4.在肝癌与癌旁组织验证了ANXA5、Pak3、eⅠFSA、PrxⅣ的差界表达;5.在P28GANK过表达细胞系验证了P28GANK可下调eⅠF5A的表达;6.对iTRAQ标记质谱数据进行处理,完成生物信息学分类。结论:我们成功运用了腺病毒介导的RNA干扰沉默肝癌癌基因P28GANK的表达,证实下调它的表达可诱发细胞凋亡;我们用iTRAQ方法与串联质谱相结合共成功检测出了近700个蛋白,其中436个蛋白在凋亡过程中有显著量的改变,包括细胞周期蛋白、分解代谢蛋白、生物合成蛋白、大分子代谢蛋白、氧化应激和急性期反应蛋白、蛋白质与细胞增生相关蛋白等,表明肝癌癌蛋白P28对肝癌细胞具有广泛调控作用,对其中一些差异蛋白,如PrxⅣ、eⅠF5A、Pak3的验证及在临床样本中的表达特征分析,结合这些分子的生物学功能提示P28可能通过这些分子影响肝癌的恶性行为。它们也有可能成为肝癌生物治疗的候选靶点。