真菌免疫调节蛋白（FIP）在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中的重组表达及其生物学活性的研究

论文摘要

真菌免疫调节蛋白是一类从大型食（药）用真菌中提取出来的具有免疫调节活性的小分子蛋白。到目前为止,共有七种真菌免疫调节蛋白分别从灵芝、松杉灵芝、金针菇、草菇、紫芝、小孢子灵芝和甜芝中被发现。真菌免疫调节蛋白具有和凝集素相类似的结构和生物学功能,其免疫调节活性主要表现为促进淋巴细胞增殖,诱导免疫细胞分泌多种细胞因子（白介素、肿瘤坏死因子、干扰素等）。另外,真菌免疫调节蛋白具有一定的抗肿瘤活性。本论文从灵芝菌丝体和金针菇子实体基因组中克隆出编码两种真菌免疫调节蛋白（LZ-8和FIP-fve）的基因,构建了毕赤酵母GS115重组表达这两种蛋白的载体pPIC9-LZ-8和pPIC9-FIP-fve。通过电转化法将目的基因转化至酵母中,经组氨酸缺失培养基筛选和PCR鉴定获得正确的酵母转化子。将重组的酵母菌进行液体摇瓶振荡培养并通过添加甲醇诱导重组蛋白的表达,重组蛋白的表达量可达191 mg L-1（reLZ-8）和158 mg L-1（reFIP-fve）。重组蛋白的发酵液经过超滤膜超滤,DEAE-A25葡聚糖离子柱层析,HPLC层析,低温透析和冷冻干燥后获得纯化的重组蛋白,蛋白纯度达到85%以上。Western blot结果表明重组表达的蛋白为正确表达的目的蛋白。对重组蛋白的氨基酸组分分析表明重组表达的真菌免疫调节蛋白具有和天然蛋白相同的氨基酸组分。圆二色谱（CD）分析检测出的重组蛋白质二级结构单元具有和天然蛋白一致的二级结构比例,说明毕赤酵母表达的重组真菌免疫调节蛋白能够正确折叠且形成具有生物学活性的形式。糖含量分析表明重组真菌免疫调节蛋白分别含有1.8%和1.2%的中性糖,比天然的蛋白稍高,说明重组免疫调节蛋白在酵母表达系统中有可能发生了糖基化修饰。重组真菌免疫调节蛋白纯化后,对其生物学活性进行了测定。血细胞凝集实验表明,重组真菌免疫调节蛋白表现出与天然免疫调节蛋白一致的血细胞凝集活性和特异性。采用MTT法测定的结果表明,重组蛋白具有促进小鼠脾淋巴细胞增殖的活性。间接ELISA方法检测的重组蛋白对细胞因子分泌作用的结果表明,重组灵芝和金针菇免疫调节蛋白均可明显提高小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子—白介素2（IL-2）。此外,采用流式细胞术测定重组免疫调节蛋白的体外抗肿瘤活性表明,重组灵芝免疫调节蛋白对人类早期白细胞NB4具有明显的杀伤作用,最大抑制率为32%,其作用机制可能是诱导癌细胞的凋亡。本论文获得了两种真菌免疫调节蛋白在毕赤酵母GS115中的高效重组表达,并证实了重组真菌免疫调节蛋白具有和天然蛋白相类似的生物学活性。这些研究结果将为深入研究真菌免疫调节蛋白的作用机理和重组蛋白在抗过敏、抗肿瘤和医药保健等方面的应用提供了一定的基础和依据。进一步的研究重组真菌免疫调节蛋白生物学活性以及与淋巴细胞和肿瘤细胞的相互作用等工作正在进行中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 药用真菌资源与利用
• 1.2 真菌免疫调节蛋白
• 1.3 本论文研究目的
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法（技术路线）
• 3 结果与分析
• 3.1 真菌免疫调节蛋白基因的克隆
• 3.2 重组酵母表达载体的构建
• 3.3 重组酵母转化子的获得
• 3.4 重组真菌免疫调节蛋白的诱导表达和纯化
• 3.5 重组真菌免疫调节蛋白的氨基酸组分和二级结构分析
• 3.6 重组真菌免疫调节蛋白的糖含量分析
• 3.7 重组灵芝真菌免疫调节蛋白的WESTERN BLOT 检测
• 3.8 重组真菌免疫调节蛋白的生物学活性测定
• 4 讨论
• 4.1 真菌免疫调节蛋白基因的选择
• 4.2 灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白基因在毕赤酵母中的重组表达
• 4.3 重组表达的灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白的生物学特性分析
• 4.4 重组灵芝和金针菇真菌免疫调节蛋白的生物学活性
• 4.5 深入展开重组真菌免疫调节蛋白作用机理研究的建议
• 4.6 关于毕赤酵母表达系统
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢