纤维素一步法发酵产乙醇的初步研究

论文摘要

纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的有机物质,是一类重要的可再生资源和能源。但由于纤维素分子结构的特殊性,使这类宝贵资源很难被利用。乙醇的燃烧值低于汽油,但由于其环保和可再生等优越性,已成为化石燃料良好的代替品。本研究从目前纤维素糖化最适反应温度与酵母最适发酵温度不符的问题入手。通过筛选到可以与常温酵母发酵温度同步的低温酶,或与纤维素酶反应温度同步的耐高温酵母,克服纤维素同步糖化发酵法的这一技术瓶颈。实验获得纤维素酶生产菌（Neurospora intermedia）一株。其最适生长温度28℃,最适生长pH值5.0；产生的纤维素酶最适酶活温度42℃,低于目前大多数商业纤维素酶的最适反应温度,最适反应pH值5.0。同时获得耐高温酵母（Candida krusei）一株。其最高生长温度50℃,在42℃发酵产生5.8%的乙醇,高于30℃时发酵的乙醇产率。糖源需求量低,可在不含糖源的有机培养基上生长。使用上述菌株进行耦联发酵,发现酵母的生长受到一定程度的限制,多以营养体形式存活。但当向糖化液中加入B-葡萄糖苷酶时,抑制解除,酵母菌生长良好,并可发酵产生乙醇。为解决这一问题,本研究尝试使用分子生物学的手段将β-葡萄糖苷酶基因导入酵母菌体内以达到更好的利用纤维素水解产物的目的。实验已构建酵母穿梭质粒二个,pYESKB和pPIRPKT。pYESKB为游离型质粒,pPIRPKT为整合型质粒,均以G418抗性作为筛选标记。本研究工作以纤维素为原料,使用研究中分离得到的纤维素酶产生菌与耐高温酵母进行同步糖化发酵（SSF）获得了阶段性的成功。为今后的纤维素酶酶学研究提供了相应的实验基础；为同步糖化发酵提供了有用的实验材料；为工程菌的改造提供了相应的试验材料及可行性研究思路。实验证明了通过低温纤维素酶与耐高温酵母一步法耦联发酵产乙醇的可行性,纤维素发酵产乙醇提供了一条可以借鉴的方向。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图与附表清单
• 第一章 绪论
• 1.1 燃料乙醇的发展及研究现状
• 1.1.1 世界燃料乙醇的发展概况
• 1.1.2 我国燃料乙醇的发展概况
• 1.2 纤维素与纤维素酶
• 1.2.1 纤维素简述
• 1.2.2 纤维素酶与纤维素酶生产菌
• 1.2.3 燃料乙醇的研究现状
• 1.3 耐高温酵母
• 1.4 基因工程
• 1.4.1 基因工程菌
• 1.4.2 载体的选择
• 1.4.3 选择标记的选择
• 1.5 纤维素同步糖化发酵
• 1.6 本课题立题依据
• 第二章 纤维素酶产生菌的分离鉴定与部分酶学性质研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 纤维素酶生产菌的初筛
• 2.2.2 纤维素酶生产菌的复筛
• 2.2.3 真菌的鉴定
• 2.2.4 部分酶学性质研究
• 2.2.5 菌株保藏
• 2.3 结果
• 2.3.1 纤维素酶生产菌的初筛
• 2.3.2 纤维素酶生产菌的复筛
• 2.3.3 真菌的鉴定
• 2.3.4 部分酶学性质研究
• 2.4 小结与讨论
• 第三章 耐高温酵母的分离与鉴定
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 样品采集
• 3.1.2 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 耐高温酵母菌的初筛
• 3.2.2 耐高温酵母菌的复筛
• 3.2.3 酵母菌的鉴定
• 3.2.4 酵母菌子囊孢子观察
• 3.2.5 克鲁丝假丝酵母M-39糖源同化试验
• 3.2.6 克鲁丝假丝酵母M-39生长曲线
• 3.2.7 克鲁丝假丝酵母M-39耐盐性试验
• 3.2.8 克鲁丝假丝酵母M-39耐糖性试验
• 3.2.9 克鲁丝假丝酵母M-39乙醇耐受性试验
• 3.2.10 克鲁丝假丝酵母M-39酸碱耐受性试验
• 3.2.11 克鲁丝假丝酵母M-39温度致死试验
• 3.2.12 克鲁丝假丝酵母M-39发酵能力试验
• 3.3 结果
• 3.3.1 耐高温酵母菌的初筛
• 3.3.2 耐高温酵母菌的复筛
• 3.3.3 酵母菌的鉴定
• 3.3.4 酵母菌子囊孢子观察
• 3.3.5 克鲁丝假丝酵母M-39糖源同化试验
• 3.3.6 克鲁丝假丝酵母M-39生长曲线
• 3.3.7 克鲁丝假丝酵母M-39耐盐性试验
• 3.3.8 克鲁丝假丝酵母M-39耐糖性试验
• 3.3.9 克鲁丝假丝酵母M-39乙醇耐受性试验
• 3.3.10 克鲁丝假丝酵母M-39酸碱耐受性试验
• 3.3.11 克鲁丝假丝酵母温度致死试验
• 3.3.12 克鲁丝假丝酵母发酵能力试验
• 3.4 小结与讨论
• 第四章 同步糖化发酵
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 商业纤维素酶
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酵母菌在培养基中的数量变化检测
• 4.2.2 同步糖化发酵
• 4.3 结果
• 4.3.1 酵母菌数量变化结果
• 4.3.2 同步糖化发酵结果
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 野生菌基因工程改造的初步探索
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 试验菌株与质粒
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 分子克隆操作分子克隆用酶与试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 大肠杆菌中质粒的提取
• 5.2.2 酵母菌中游离质粒的提取
• 5.2.3 酵母染色体的提取
• 5.2.4 PCR反应
• 5.2.5 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收
• 5.2.6 限制性核酸内切酶酶切
• 5.2.7 大肠杆菌感受态制作
• 5.2.8 酵母菌电转化感受态制作
• 5.2.9 大肠杆菌转化
• 5.2.10 酵母菌转化
• 5.3 结果
• 5.3.1 Bgl1基因的克隆
• 5.3.2 rRNA基因部分基因序列的克隆
• 5.3.3 启动子与终止子基因序列的克隆
• r抗性基因序列的克隆'>5.3.4 Kan^r抗性基因序列的克隆
• 5.3.5 质粒pYES2KB的构建
• 5.3.6 质粒pYIRPK的构建
• 5.4 小结与讨论
• 第六章 总结与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A
• 附录B