重组大肠杆菌高效生产具生物活性的人β-防御素和牛肠激酶的研究

论文摘要

人β-防御素是近来年发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。肠激酶是哺乳动物肠道内的一种丝氨酸蛋白水解酶，能够特异性的识别（Asp）4-Lys序列，起到把胰蛋白酶原转变成胰蛋白酶的作用。本论文研究了使用基因工程技术生产人β-防御素3及4（HBD3、HBD4）和牛肠激酶轻链（BEKLC）的方法。建立了从获得HBD3、HBD4和牛肠激酶轻链基因、载体构建、表达优化、产物分离纯化、BEKLC包涵体复性，直到生物活性测定等的完整工艺。经过密码子优化全基因合成了HBD3及4的基因，构建了大肠杆菌融合表达HBD3及4的基因工程菌，通过对摇瓶表达条件的研究，获得了如下的优化培养条件：在MBL培养基，培养温度为34℃，在对数生长中期添加终浓度为0.4 mM的IPTG进行诱导的情况下，HBD3和HBD4重组菌分别诱导8 h和6h终止发酵，首次实现了融合蛋白的高水平表达。HBD3融合蛋白的产量为2.55g／L，HBD4融合蛋白的产量达到2.68 g／L。经过密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因（sBEKLC），采用质粒pET-39b（+）构建了融合表达载体，成功地在大肠杆菌中进行了表达，融合蛋白产量达到151.2 mg／L，i.e.80.6 mg／L sBEKLC。使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC，经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8mg sBEKLC，在类似的研究工作中处于较高的水平。经检测，sBEKLC具有生物活性。部分表达的sBEKLC融合蛋白为不可溶，应用镍离子金属螯地合层析对包涵体进行了纯化和复性研究，优化的复性条件为：50 mM Tris-HCl（pH 8.0），0.3 MNaCl，2 Murea，10 mM Imidazole，3 mM GSH，0.6 mM GSSG条件下，复性6 h结束，复性产物具有生物活性。将自制的肠激酶轻链成功地用于人防御素融合蛋白的切割以释放出有生物活性的成熟的产物。对重组菌生产的人β-防御素-3及4的分离纯化工艺进行了研究，分别建立了成熟HBD3总收率为41％、纯度为92％和成熟HBD4总收率为44％、纯度为95％的分离提纯工艺；测定了成熟产物的生物活性，所得重组蛋白经测定具有抑菌活性。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 人防御素
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 人防御素的组织分布
• 1.1.3 人防御素的分子生物学特征
• 1.1.4 人防御素的抗菌机理
• 1.1.5 人防御素的医学价值和前景展望
• 1.1.6 基因工程生产人防御素的研究进展
• 1.2 肠激酶
• 1.2.1 引言
• 1.2.2 肠激酶的结构特点
• 1.2.3 肠激酶的识别序列
• 1.2.4 肠激酶的理化和生理特点
• 1.2.5 基因工程菌生产肠激酶
• 1.3 真核生物基因在大肠杆菌中的表达
• 1.3.1 密码子优化
• 1.3.2 融合表达体系
• 1.4 包涵体蛋白质的体外折叠复性
• 1.4.1 包涵体的制备
• 1.4.2 包涵体的变性溶解
• 1.4.3 蛋白质的体外复性方法
• 1.5 本课题研究思路及拟研究的内容
• 参考文献
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 抗体
• 2.1.4 工具酶及试剂盒
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验及分析方法
• 2.2.1 分子克隆相关实验
• 2.2.2 大肠杆菌菌体浓度测定
• 2.2.3 大肠杆菌细胞破碎及胞内蛋白提取
• 2.2.4 蛋白浓度测定
• 2.2.5 SDS-PAGE电泳
• 2.2.6 Western Blotting 分析
• 参考文献
• 第三章 人β-防御素-3及4基因的合成和表达载体的构建
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 质粒和菌株
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 酶和试剂盒
• 3.2.4 引物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 密码子优化
• 3.3.2 全基因合成(PCR-based gene SOEing synthesis
• 3.3.3 琼脂糖凝胶回收纯化 DNA
• 3.3.4 克隆载体的构建
• 3.3.5 质粒的提取和转化
• 3.3.6 表达载体和表达菌株的构建
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 密码子优化
• 3.4.2 全基因合成
• 3.4.3 克隆载体构建
• 3.4.4 表达载体构建
• 3.5 小结
• 参考文献
• 第四章 重组人β-防御素-3及4的表达优化
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 人β-防御素-3及4的表达和western blotting分析
• 4.3.2 表达条件的优化
• 4.3.3 表达产物定量分析
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 HBD3融合蛋白的表达
• 4.4.2 HBD3重组菌培养条件优化
• 4.4.3 HBD4融合蛋白的表达
• 4.4.4 HBD4重组菌培养条件优化
• 4.5 小结
• 参考文献
• 第五章 牛肠激酶轻链基因的合成及在大肠杆菌中的表达
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 质粒和菌株
• 5.2.2 培养基
• 5.2.3 酶和试剂盒
• 5.2.4 引物
• 5.2.5 分离设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 密码子优化
• 5.3.2 全基因合成（PCR-based gene SOEing synthesis）
• 5.3.3 琼脂糖凝胶回收纯化 DNA
• 5.3.4 克隆载体的构建
• 5.3.5 质粒的提取和转化
• 5.3.6 表达载体和表达菌株的构建
• 5.3.7 菌体培养及蛋白表达
• 5.3.8 亲和层析
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 密码子优化
• 5.4.2 全基因合成
• 5.4.3 克隆载体构建
• 5.4.4 表达载体构建
• 5.4.5 目标蛋白的表达
• 5.4.6 亲和层析分离融合蛋白
• 5.5 小结
• 参考文献
• 第六章 牛肠激酶轻链的纯化和活性测定
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 菌种
• 6.2.2 培养基
• 6.2.3 分离设备
• 6.2.4 透析袋
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 渗透冲击法提取蛋白
• 6.3.2 表达条件的优化
• 6.3.3 亲和层析
• 6.3.4 透析
• 6.3.5 目标蛋白活性分析
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 渗透冲击提取目标蛋白
• 6.4.2 渗透冲击所得蛋白的活性鉴定
• 6.4.3 表达条件的优化
• 6.4.4 从渗透冲击液中提纯肠激酶
• 6.4.5 sBEKLC1SX的活性检测
• 6.5 小结
• 第七章牛肠激酶轻链的金属亲和层析复性
• 7.1 引言
• 7.2 实验材料
• 7.2.1 菌种
• 7.2.2 培养基
• 7.2.3 分离设备
• 7.3 实验方法
• 7.3.1 菌体培养及蛋白表达
• 7.3.2 融合蛋白包涵体的制备
• 7.3.3 融合蛋白包涵体的变性溶解
• 7.3.4 融合蛋白包涵体的亲和复性
• 7.3.5 亲和复性条件的优化
• 7.3.6 Sephadex G-10脱盐
• 7.3.7 复性产物活性分析
• 7.4 结果与讨论
• 7.4.1 融合蛋白包涵体的制备
• 7.4.2 目标蛋白的亲和复性与纯化
• 7.4.3 目标蛋白亲和复性的条件优化
• 7.4.4 复性产物的活性检测
• 7.5 小结
• 参考文献
• 第八章 重组人β-防御素-3及4的分离纯化
• 8.1 引言
• 8.2 实验材料
• 8.2.1 蛋白酶
• 8.2.2 分离设备
• 8.3 实验方法
• 8.3.1 亲和层析纯化 HBD3、HBD4融合蛋白
• 8.3.2 阳离子交换层析纯化 HBD3融合蛋白
• 8.3.3 Sephadex G-10更换酶切缓冲液
• 8.3.4 肠激酶酶切融合蛋白
• 8.3.5 阳离子交换层析纯化 HBD3及 HBD4
• 8.3.6 Sephadex G-10脱盐
• 8.3.7 冷冻干燥
• 8.4 结果与讨论
• 8.4.1 亲和层析纯化融合蛋白
• 8.4.2 阳离子交换层析纯化 HBD3融合蛋白
• 8.4.3 肠激酶酶切融合蛋白
• 8.4.4 阳离子交换层析分离重组 HBD3及 HBD4
• 8.4.5 HBD3及 HBD4的精制
• 8.4.6 分离工艺总结
• 8.5 小结
• 第九章 重组人β防御素-3及4的活性测定
• 9.1 引言
• 9.2 实验材料
• 9.2.1 菌种
• 9.2.2 牛津杯
• 9.2.3 培养基
• 9.3 实验方法
• 9.3.1 测试菌的培养
• 9.3.2 液体培养法测定抑菌活性
• 9.3.3 固体平板扩散法测定抑菌活性
• 9.4 结果与讨论
• 9.4.1 液体培养法测定抑菌活性
• 9.4.2 固体平板扩散法
• 9.5 小结
• 第十章 结论与建议
• 10.1 结论
• 10.2 建议
• 致谢
• 论文发表情况