普鲁兰酶在解淀粉芽孢杆菌中表达方法的探索

论文摘要

普鲁兰酶水解支链淀粉中α-1,6-糖苷键,在淀粉糖生产中具有重要用途。目前已发现的来源于芽孢杆菌及其近缘种属的普鲁兰酶分子量都在100 kDa左右,由于分子量大其分泌表达有很大的困难。本文探索以解淀粉芽孢杆菌为宿主表达普鲁兰酶的方法。解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株（Bacillus amyloliquefaciens BF7658）是我国自主开发的中温α-淀粉酶工业生产菌。由于解淀粉芽孢杆菌BF7658具有高产淀粉酶的特点,因此其淀粉酶基因启动子是构建表达载体的理想材料。本文以解淀粉芽孢杆菌BF7658染色体DNA为模板扩增获得其启动子和信号肽编码区基因片段Pamy,与大肠杆菌质粒pBR322的复制原件pMB1 ori、穿梭质粒pHY300PLK的芽孢杆菌复制元件ori-pama以及四环素抗性基因tet进行DNA重组,构建了适用于解淀粉芽孢杆菌的分泌表达载体pCHA03。解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株在发酵后期有芽孢形成并停止产酶的特点,破坏其芽孢形成能力有可能延长发酵产酶时间。以红霉素抗性为标记构建了针对解淀粉芽孢杆菌BF7658菌株芽孢形成关键基因spoIIAC（psp）的基因敲除载体pHY-psp-pem。利用载体pHY-psp-pem转化解淀粉芽孢杆菌BF7658,通过传代筛选最终获得一株spoIIAC基因缺失的菌株,命名为解淀粉芽孢杆菌sj08。解淀粉芽孢杆菌sj08与表达载体pCHA03共同组成一套新型芽孢杆菌分泌表达系统。将普鲁兰酶编码基因BdP插入pCHA03以及枯草芽孢杆菌表达载体pUC980多克隆位点,构建重组质粒pUC980-BdP和pCHA03-BdP。将上述重组质粒分别转化枯草芽孢杆菌1A717和解淀粉芽孢杆菌BF7658。摇瓶发酵实验显示两种质粒转化枯草芽孢杆菌得到的转化子发酵液中均只有微弱的普鲁兰酶酶活。pUC980-BdP和pCHA03-BdP转化解淀粉芽孢杆菌BF7658得到的重组菌摇瓶发酵最高酶活分别达到1.1 ASPU/mL和3.1 ASPU/mL。以解淀粉芽孢杆菌BF7658为宿主的重组菌发酵水平明显高于以枯草芽孢杆菌为宿主的重组菌。以解淀粉芽孢杆菌BF7658为宿主时,利用其自身淀粉酶基因启动子和信号肽能更有效的实现普鲁兰酶的分泌表达。将pCHA03-BdP转入解淀粉芽孢杆菌sj08,获得重组菌解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP。15 L发酵罐发酵试验表明解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP的发酵产酶时间比解淀粉芽孢杆菌BF7658/pCHA03-BdP延长8 h,发酵液酶活提高23%以上。对解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP发酵条件进行优化,在优化条件下重组菌普鲁兰酶发酵水平达到6.9 ASPU/mL。纯化了解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP表达的普鲁兰酶,研究了纯酶的酶学性质。通过纯化,从发酵液中获得了电泳纯的普鲁兰酶。酶回收率为20.1%,纯化倍数为49.9。该酶分子量大约为100 kDa。重组普鲁兰酶最适作用温度为60℃,最适pH为5.0,60℃保温3 h后酶活仍保存50%左右。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 芽孢杆菌表达系统
• 1.1.1 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.1.2 其他芽孢杆菌表达系统
• 1.1.3 解淀粉芽孢杆菌及其遗传工程
• 1.2 细菌普鲁兰酶及其编码基因
• 1.3 本课题研究内容和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 质粒提取与纯化试剂
• 2.1.3 工具酶与主要生化试剂
• 2.1.4 培养基与培养条件
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 大肠杆菌质粒的提取
• 2.2.2 普鲁兰酶基因的PCR 扩增
• 2.2.3 PCR 产物的纯化回收
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞转化
• 2.2.6 解淀粉芽孢杆菌染色体DNA 的提取
• 2.2.7 载体构建引物设计
• 2.2.8 枯草芽孢杆菌感受态的制备及转化
• 2.2.9 解淀粉芽孢杆菌的电转化
• 2.2.10 枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌质粒的大量提取
• 2.2.11 重组质粒的稳定性分析
• 2.2.12 发酵实验
• 2.2.13 酶活测定方法
• 2.2.14 重组普鲁兰酶的纯化
• 2.2.15 重组普鲁兰酶酶学性质分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 解淀粉芽孢杆菌分泌表达载体pCHA03 的构建
• 3.1.1 解淀粉芽孢杆菌启动子Pamy 的PCR 扩增
• 3.1.2 表达载体pCHA03 的构建
• 3.1.3 表达载体pCHA03
• 3.2 解淀粉芽孢杆菌BF7658 芽孢形成关键基因spoIIAC 的敲除
• 3.2.1 基因敲除载体的构建
• 3.2.2 解淀粉芽孢杆菌芽孢形成关键基因spoIIAC 的敲除
• 3.3 重组质粒pUC980-BdP 和pCHA03-BdP 的构建
• 3.3.1 重组质粒pCHA03-BdP 的构建
• 3.3.2 重组质粒pUC980-BdP 构建
• 3.4 普鲁兰酶基因在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.4.1 普鲁兰酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.4.2 重组酶普鲁兰酶性质分析
• 3.4.3 普鲁兰酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.5 普鲁兰酶在解淀粉芽孢杆菌BF7658 中的分泌表达
• 3.5.1 解淀粉芽孢杆菌BF7658/pUC980-BdP 普鲁兰酶表达情况
• 3.5.2 解淀粉芽孢杆菌BF7658/pCHA03-BdP 普鲁兰酶表达情况
• 3.5.3 重组质粒pCHA03-BdP 的稳定性分析
• 3.5.4 解淀粉芽孢杆菌BF7658/pCHA03-BdP 的15L 罐发酵实验
• 3.6 普鲁兰酶在解淀粉芽孢杆菌sj08 中的分泌表达
• 3.6.1 以解淀粉芽孢杆菌sj08 为宿主表达普鲁兰酶情况分析
• 3.6.2 解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP 的15 L 罐发酵实验
• 3.6.3 解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP 摇瓶发酵条件优化
• 3.6.4 优化条件下解淀粉芽孢杆菌sj08/pCHA03-BdP 的15 L 罐发酵实验
• 3.7 重组普鲁兰酶的纯化与酶学性质分析
• 3.7.1 重组普鲁兰酶的纯化
• 3.7.2 重组普鲁兰酶酶学性质分析
• 3.8 不同表达系统分泌表达普鲁兰酶的比较
• 主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文