论文摘要
第一部分p38MAPK基因pshRNA载体质粒的构建目的:构建靶向基因p38MAPK的短发夹状RNA重组质粒载体。方法:根据siRNA设计原则,设计2对正反义寡核苷酸链,同时设阴性对照,退火后形成双链,两端分别加上对应的酶切位点,形成siRNA的DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制p38MAPK基因的siRNA表达载体。酶切鉴定,测序证实。结果:重组pshRNA表达载体经限制性内切酶酶切鉴定,并进一步测序分析证实,重组质粒连接正确且无突变。结论:成功构建靶向基因p38MAPK的短发夹状RNA重组质粒载体（pshRNA-p38MAPK）,构建的重组质粒分别命名为pshRNA-p38MAPK1、pshRNA-p38MAPK2和pshRNA-hk。这为进一步研究p38MAPK通路在高糖诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用奠定基础。第二部分p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用目的:探讨p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用。方法:体外培养人肾小管上皮细胞。首先通过脂质体转染重组质粒pshRNA-p38MAPK,检测pshRNA-p38MAPK对人肾小管上皮细胞（HK2）p38MAPK表达的抑制作用。将肾小管上皮细胞分为:正常对照组（NG,只加脂质体）、pshRNA-p38MAPK1（p38MAPK1）组pshRNA-p38MAPK2（p38MAPK2）组及pshRNA-hk组。在进一步探讨p38MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用时,将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK2）分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、无关对照pshRNA-hk转染组（RG）、预转染pshRNA-p38MAPK24h组（24hG）、预转染pshRNA-p38MAPK48h组（48hG）。倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态的改变;ELISA法测定培养液上清中纤连蛋白（FN）的浓度变化; EMSA法检测HK2细胞AP-1的改变;免疫细胞化学法检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞角蛋白（cytokine）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白（vimentin）的表达;RT-PCR法检测vimentin mRNA、CK mRNA及Snail mRNA的表达;Western blot及RT-PCR法检测p38 MAPK的变化、E-cadherin及α-SMA的表达。结果:pshRNA-p38MAPK重组质粒能够成功地在肾小管上皮细胞细胞内表达,并能抑制p38MAPK基因的表达。高糖作用48h后,HK2细胞由椭圆形贴壁生长变为长梭形,胞体拉长,透射电镜下,细胞表面微绒毛明显减少,胞浆内粗面内质网丰富,而转染pshRNA-p38MAPK组较高糖组明显减轻。Western blot检测显示, pshRNA-p38MAPK能显著抑制高糖诱导的p38MAPK过度活化。EMSA结果分析表明,在高糖刺激下AP-1结合活力较正常对照组显著增加（P<0.05）;而pshRNA-p38MAPK可明显抑制AP-1的活化,与高糖组和无关转染组相比差异有统计学意义（P<0.05）。高糖刺激HK2细胞后,FN蛋白水平显著高于正常对照组（54.89±2.30ng/ml vs. 11.25±1.31ng/ml, P<0.05）;转染pshRNA-p38MAPK后,HK2细胞FN蛋白水平显著低于高糖组和无关转染组（P<0.05）。RT-PCR检测显示,高糖诱导肾小管上皮细胞Snail mRNA表达明显增加,而转染pshRNA-p38MAPK组Snail mRNA表达水平较高糖组和无关转染组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫细胞化学和RT-PCR检测显示,高糖诱导肾小管上皮细胞CK mRNA和蛋白水平明显降低,而vimentin mRNA和蛋白水平明显增高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;转染pshRNA-p38MAPK组与高糖组和无关转染组相比,肾小管上皮细胞CK mRNA和蛋白水平明显增高,而vimentin mRNA和蛋白水平明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫细胞化学和Western blot法检测显示,高糖诱导肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白水平明显降低,而α-SMA蛋白水平明显增高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;转染pshRNA-p38MAPK组与高糖组和无关转染组相比,肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白水平较明显增高,而α-SMA蛋白水平明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:高糖可通过p38MAPK的激活,诱导Snail表达而下调E-cadherin表达,并抑制CK表达,同时导致α-SMA、vimentin等间充质细胞表型的重新表达,最终导致肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞,合成大量FN,使细胞外基质沉积增多,参与糖尿病肾病肾间质纤维化的发生发展;pshRNA-p38MAPK能有效抑制HK2细胞中的p38MAPK基因的表达,抑制高糖所诱导的转分化的发生,该研究结果为糖尿病肾病的基因治疗提供了重要的实验依据。高糖可诱导HK2细胞AP-1 DNA结合活性的升高,并受p38MAPK信号通路的调控。但AP-1活化是否参与高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化,尚需我们进一步研究。第三部分AP-1在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用目的:探讨AP-1在高糖诱导的肾小管上皮细胞表型转化中的作用。方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK2）分为正常对照组（NG）、高糖组（HG）、AP-1阻断组（AG）。倒置显微镜、透射电镜观察细胞形态的改变; EMSA法检测HK2细胞AP-1的改变;ELISA法测定培养液上清中纤连蛋白（FN）的浓度变化;免疫细胞化学法检测E-钙黏蛋白（E-cadherin）、细胞角蛋白（CK）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和波形蛋白（vimentin）的表达;RT-PCR法检测vimentin mRNA、CK mRNA及Snail mRNA的表达;Western blot法检测E-cadherin及α-SMA的表达。结果:高糖作用48h后,HK2细胞由椭圆形贴壁生长变为长梭形,胞体拉长,透射电镜下,细胞表面微绒毛明显减少,胞质内粗面内质网丰富,而AP-1阻断组较高糖组明显减轻。EMSA结果分析表明,在高糖刺激下AP-1结合活力较正常对照组增加79.22%（P<0.05）,而AP-1阻断剂可明显抑制AP-1的活化,较高糖组降低51.19%（P<0.05）。高糖刺激HK2细胞后,FN蛋白水平显著高于正常组（55.22±2.06ng/ml vs. 9.99±1.68ng/ml, P<0.05）;而AP-1阻断剂处理后,HK2细胞FN蛋白水平显著低于高糖组（30.25±0.59ng/ml vs. 55.22±2.06ng/ml, P<0.05）。RT-PCR检测显示,高糖诱导肾小管上皮细胞Snail mRNA表达明显增加,而AP-1阻断组Snail mRNA表达水平较高糖组明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫细胞化学和RT-PCR检测显示,高糖诱导肾小管上皮细胞CK mRNA和蛋白水平明显降低,而vimentin mRNA和蛋白水平明显增高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;AP-1阻断组与高糖组相比,肾小管上皮细胞CK mRNA和蛋白明显增高,而vimentin mRNA和蛋白水平明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫细胞化学和Western blot法检测显示,高糖诱导肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白水平明显降低,而α-SMA蛋白水平明显增高,与正常对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）;与高糖组相比,AP-1阻断组的肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白水平明显增高,α-SMA蛋白水平明显降低,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:高糖可导致肾小管上皮细胞AP-1活化,诱导Snail表达而下调E-cadherin表达,并抑制CK表达,同时导致α-SMA、vimentin蛋白等间充质细胞表型的重新表达,最终诱导其表型转化,合成大量FN,导致糖尿病肾间质纤维化的发生。