缺氧性脑损伤致痫性发作机制的实验研究

论文摘要

第一部分缺氧性脑损伤致痫性发作及其敏感性改变机制研究第一节大鼠缺氧性脑损伤模型建立和评价目的:大鼠缺氧性脑损伤（Hypoxic brain injury）模型建立和评价,为脑缺氧损伤相关病理生理机制研究提供实验基础。方法:采用成年雄性SD大鼠,以8%氮氧混合气体缺氧后,观察其行为学、脑电图改变,并将脑组织行Nissle染色和电镜检测取材,采用光镜和透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）观察皮层和海马病理学变化。结果:缺氧组大鼠出现明显易激惹,不易抓取;脑电图呈现不同形式慢波,偶有痫性放电;Nissle染色显示神经元胞浆浓缩深染,排列紊乱稀疏,细胞体突起减少;TEM显示神经元不规则,异染色质增多,核周间隙明显扩大,线粒体肿胀,空泡变性,嵴模糊不清,粗面内质网及核糖体减少。结论:采用氮氧混合气体对大鼠进行缺氧,建立缺氧性脑损伤模型,该模型可模拟缺氧性脑病后脑损害病理过程,为缺氧性脑病所致脑损伤及其相关病理生理机制研究提供动物模型。第二节缺氧性脑损伤致大鼠亚临床痫性发作及海马苔藓纤维出芽目的:观察缺氧性脑损伤后亚临床痫性发作及其与海马苔藓纤维出芽（Mossy fiber sprouting,MFS）和胶质原纤维酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein,GFAP）关系,探讨缺氧性脑损伤致痫性发作相关病理机制方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组（Control）（n=12）与缺氧组（Hypoxia）（n=91）,经8%氧氮混合气体缺氧,依据大鼠脑电活动变化,再将缺氧大鼠分成亚临床痫性发作组（Subclinical seizures）与非亚临床痫性发作组（Non-subclinical seizures）,并分别用Nissle染色、Timm染色、免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）和免疫蛋白印记（Western blot）等方法观察皮层、海马神经病理学改变,海马MFS以及海马,皮层GFAP表达。结果:缺氧损伤后部分大鼠出现尖波、尖慢波和棘波,痫样放电发生率为23.08%（21/91）。较非亚临床痫性发作组和对照组,亚临床痫性发作组CA1、CA3区、颞叶皮质神经元脱失明显（P<0.05）;该组缺氧后7d海马CA3区下锥体细胞层棕黑色颗粒增多,14d呈束状、斑片状颗粒沉积,28d呈现颗粒沉积条带,其CA3区MFS评分明显高于非亚临床痫性发作组和对照组（P<0.05）,而三组齿状回（Dentate gyrus,DG）内分子层MFS评分差异无统计学意义（P>0.05）;亚临床痫性发作组GFAP表达明显增强,以海马为著,与非亚临床痫性发作组比较,差异有显著性（P<0.05）。结论:缺氧损伤可致大鼠痫样放电,且痫样放电大鼠出现明显神经元丢失、海马CA3区形成MFS以及脑内GFAP表达增加,此病理变化可能与缺氧性脑损伤后亚临床痫性发作有关。第三节缺氧性脑损伤致大鼠痫性发作敏感性和脑内PSD-95、VGluT1、VGluT 2表达改变目的:观察缺氧性脑损伤大鼠痫性发作敏感性,及其突触后致密物质-95（Postsynaptic density-95,PSD-95）,囊泡膜谷氨酸转运载体-1,-2（Vesicular glutamate transporter subtype 1,subtype 2,VGluT1,VGluT 2）免疫反应改变以及相关脑区神经元丢失。探讨缺氧性脑损伤致痫性发作敏感性改变的病理机制。方法:成年雄性SD大鼠随机分为对照组（Control）（n=35）和缺氧组（Hypoxia）（n=35）,以8%氧氮混合气体建立大鼠缺氧性脑损伤模型。两组各取大鼠（n=10）腹腔注射戊四唑（ pentylenetetrazol PTZ）10mg/kg.5min检测致痫性发作阈值;两组再各取大鼠（n=15）腹腔注射PTZ 35mg/kg.2d,连续20d,进行大鼠点燃,检测癫痫点燃大鼠数目和痫性发作程度,两组动物中经PTZ点燃大鼠分别纳入单纯点燃组（Simple kindling）和缺氧后点燃组（Post-hypoxic kindling）。对照组和缺氧组剩余大鼠（n=10）与单纯点燃组和缺氧后点燃组大鼠分别采用IHC和Western blot等方法观察大鼠颞叶皮层、海马和中脑神经元脱失以及脑内PSD-95,VGluT1,VGluT 2免疫反应改变。结果:①与对照组相比,缺氧组诱导痫性发作PTZ剂量降低,且痫性发作潜伏期缩短;同时,经PTZ点燃大鼠数目明显增多,其痫性发作程度更严重（P<0.05）。②缺氧组颞叶皮层、中脑和CA1区神经元数目明显低于对照组;缺氧后点燃组颞叶皮层和CA1区较其他各组神经元丢失显著（P<0.05）。③缺氧组皮层、海马PSD-95免疫阳性细胞数和免疫印迹光密度值（0ptical density,OD）低于其他三组（P<0.05）。④缺氧组颞叶皮层和海马区VGluT1免疫阳性细胞OD明显高于对照组;而缺氧后点燃组颞叶皮层和海马区VGluT1免疫阳性细胞OD较缺氧组和单纯点燃组明显增加（P<0.05）。⑤缺氧后点燃组VGluT1免疫印迹OD高于其他三组;缺氧组VGluT1免疫印迹OD值高于对照组（P<0.05）。⑥各组海马与中脑VGluT2免疫阳性细胞与免疫印迹OD无差异（P>0.05）。结论: VGluT1免疫反应性增加,脑内PSD-95表达降低,相关脑区神经元显著丢失。上述病理变化可导致痫性发作敏感性增加和脑内兴奋性增高,对缺氧脑损伤致痫性发作敏感性改变产生重要作用。第二部分缺氧诱导海马神经元兴奋性与痫性发作改变研究第一节无血清原代培养大鼠海马神经元方法建立目的:建立大鼠海马神经元无血清原代培养方法,检测培养神经元电生理特性,为体外研究提供实验基础。方法:钝性分离新生SD大鼠双侧海马,经酶消化及吸管吹打,采用添加B27的无血清培养基培养原代海马神经元,动态观察其形态学变化;通过免疫细胞化学检测神经丝（NF-200）和神经元特异核蛋白（Neu-N）染色鉴定神经元;将培养至第8-14d神经元,采用膜片钳全细胞记录模式,检测其电生理特性。结果:培养的海马神经元可体外存活20d以上,8-14d细胞胞体呈锥形或三角形、表面光洁、折光性好、突起多而明显,形成神经网络。电生理记录显示:状态良好的神经细胞易于封接形成全细胞记录且能维持较长时间,其封接成功率80%;平均静息膜电位（RMP）为-57.7±9.2mV;电压钳下（钳制电位从-60mV～+60mV,step=l0mV,时长30ms）显示典型内向钠电流和外向钾电流;电流钳下跃阶恒流刺激（-60pA～+40pA,step=10pA,时长200ms）,大部分所记录的神经元产生动作电位,阈值43.1371±5.3245 mV,时程8.3571±3.1407ms ,动作电位幅度83.05±9.79mV。结论:采用大鼠海马神经元无血清原代培养方法,可在体外获得状态良好的海马神经元,且适用于膜片钳记录,并显示出正常神经元电生理特性。第二节不同缺氧持续时间诱导海马神经元兴奋性改变目的:探讨不同缺氧持续时间对海马神经元兴奋性相关电生理特性的影响。方法:原代培养海马神经元经（95% N2 / 5% CO2）混合气饱和人工脑脊液（Artificial cerebrospinal fluid,ACSF）灌流缺氧,选取灌流5、10、15、20、25、30、35、40min后8个时段,采用全细胞记录模式测定不同时段神经细胞膜电位,电流钳下跃阶电流（-60pA～+40pA,step=10pA,时长200ms）刺激,测定不同时段神经细胞阈强度,即诱发神经元产生动作电位的最低电流强度。对照组神经元灌流（95% O2 / 5% CO2）混合气饱和ACSF.结果:持续缺氧10、15min后神经细胞膜电位值升高,较对照组神经细胞膜电位有差异（P<0.05）;而持续缺氧25、30、35、40min后神经细胞膜电位值低于对照组膜电位（P<0.05）。神经细胞持续缺氧10、15min后,其阈强度高于对照组（P<0.05）;而持续缺氧25、30、35、40min后神经细胞阈强度低于对照组（P<0.05）。结论:缺氧早期神经细胞膜电位呈现超极化,阈强度增高,兴奋性降低;随缺氧程度加剧,神经细胞膜电位呈现去极化,阈强度减低,兴奋性增高。第三节急性缺氧对谷氨酸诱导海马神经元痫性放电的影响目的:探讨急性缺氧对谷氨酸诱导海马神经元痫性放电的影响。方法:经（95% N2/ 5% CO2）混合气饱和ACSF进行灌流原代培养海马神经细胞30min建立急性细胞缺氧模型,采用全细胞模式记录缺氧前（Pre-hypoxia）、缺氧（Hypoxia）、缺氧后10、20、30、40min（Post-hypoxic 10、20、30、40min）神经细胞膜电位,膜电容及膜入路阻抗,以确定缺氧对神经细胞膜电生理特性的影响;在电流钳下,采样程序为Gap-free模式,测定对照组（Control）、缺氧组（Hypoxia）、谷氨酸组（Glutanate）和缺氧+谷氨酸组（Hypoxia+glutamate）海马神经细胞自发动作电位,分析其放电频率;再采用相同记录模式,给予对照组与缺氧组海马神经细胞灌流2.5μmol/L谷氨酸10min,测定能否诱发出动作电位。对照组神经元灌流（95% O2 / 5% CO2）混合气饱和ACSF。结果:缺氧、缺氧后10、20、30、40min神经细胞膜电位值显著低于缺氧前（P<0.05）,缺氧后10、20、30、40min细胞膜电位无显著性差异（P>0.05）。膜电容出现与膜电位相似变化趋势,而膜入路阻抗与细胞膜电位、膜电容变化相反。各组动作电位频率（>3Hz）分布有显著差异（P<0.05）,缺氧组大于3Hz的自发性动作电位百分率显著高于对照组,缺氧+谷氨酸组大于3Hz的自发性动作电位百分率高于其他各组。灌流2.5μmol/L谷氨酸10min后,缺氧组细胞诱发出可逆性去极化和连续出现动作电位,而对照组细胞仅诱发出可逆性去极化。结论:缺氧可致神经细胞膜电生理特性改变以及自发放电频率增加,此可能减低痫样活动阈值。缺氧还致神经元痫性放电敏感性增加。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 缺氧性脑损伤致痫性发作及其敏感性改变机制研究
• 第一节 大鼠缺氧性脑损伤模型建立和评价
• 第二节 缺氧性脑损伤致大鼠亚临床痫性发作及海马苔藓纤维出芽
• 第三节 缺氧性脑损伤致大鼠痫性发作敏感性和脑内PSD-95，VGluT1，VGluT2 表达改变
• 总结
• 第二部分 缺氧诱导海马神经元兴奋性与痫性发作改变研究
• 第一节 无血清原代培养大鼠海马神经元方法建立
• 第二节 不同缺氧持续时间诱导海马神经元兴奋性改变
• 第三节 急性缺氧对谷氨酸诱导海马神元痫性放电的影响
• 总结
• 文献综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间撰写或发表的学术论文目录