香菇中γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的分离纯化及其酶学性质研究

论文摘要

香菇是一种味美、香气浓郁、营养价值丰富的食用菌,广受消费者欢迎。但近年来,因其内源性甲醛问题引发“香菇甲醛事件”,受到广泛争议。因此研究香菇内源性甲醛形成机理,进而从分子生物学角度上调控甲醛代谢,具有非常重要的意义。本课题以香菇中参与甲醛生成的关键酶--γ-谷氨酰转肽酶为研究对象,优化了酶的提取、分离和纯化条件,深入研究了该酶的基本酶学特性,并初步探索了酶的结构。本研究将为进一步阐明香菇内源性甲醛的代谢调控研究提供理论依据。主要研究结果如下：1、采用超声波辅助提取法,GGT提取率达到了8.24 U/g。与普通机械搅拌提取法相比,超声波辅助提取法提取GGT得率提高了30%,因此该方法较好的改进GGT提取工艺。选取料液比、提取时间、提取功率三个因素为超声辅助提取法的单因素试验,得到最佳条件为：提取功率、提取时间、料液比分别为200 W、30 min、1:50。选取料液比、提取时间、提取功率三个因素进行响应面实验设计,获得了超声辅助提取GGT的最佳条件,提取功率、提取时间、料液比分别为：204.84 W,28.19 min,1：52.29。在最佳提取条件下,提取液中GGT的提取率达到11.07 U/g,与理论值基本相符。2、采用硫酸铵分级沉淀对GGT粗提,选择30%硫酸铵浓度进行一级沉淀,70%硫酸铵浓度进行二级沉淀,去除部分杂蛋白,实现目标酶捕获。通过考察平衡缓冲液浓度、洗脱流速、洗脱方式确定了Phenyl-Sepharose疏水层析分离GGT酶的最优条件为：ψ2.6cm×20 cm填充柱,2 mL/min流速,0.05 mol/L Tris-HCl （pH 7.6）、1.0 mol/L（NH4）2SO4平衡缓冲体系,0.05 mol/L Tris-HCl （pH 7.6）单一浓度洗脱。粗提液经过30%-70%硫酸铵盐沉、Phenyl-Sepharose层析纯化、sephadex G-25凝胶层析脱盐后,最终获得电泳纯的GGT酶组分,其纯化倍数为178.1,得率为23.7%。采用SDS-PAGE和凝胶渗透色谱检测了纯化到的目标酶的纯度,均显示为单一组分。3、单一组分的GGT分子量为88 kDa,两个亚基的大小分别为28 kDa和60 kDa；纯化酶的氨基酸组成中,酸性氨基酸谷氨酸含量最高,亮氨酸和苏氨酸的含量也较高,而半胱氨酸和蛋氨酸的含量很低。以y-glutamyl-P-nitroanilide为底物,研究了GGT的酶学性质。酶的最适反应pH为7.6；最适反应温度为37℃,温度低于40℃时,酶表现较好的稳定性,超过60℃时,酶活性显著降低,表明该酶的耐热性较差；氧化y-glutamyl-P-nitroanilide的动力学参数Vmax和Km分别为2.601μmol/ml和0.0287 pmol/min;多种金属阳离子对该酶都有不同的影响,其中Na+、K+和Ca2+对酶活力有激活作用,而Cu2+、Ag+、Zn2+和Fe3+有效抑制酶活性。采用IEF-PAGE研究表明GGT酶的等电点为6.4。采用红外光谱（FT-IR）分析GGT二级结构,得出p折叠、无规则卷曲、α螺旋、β转角结构相对百分浓度分别为40.94%、15.90%、18.26%和24.90%。采用圆二色谱方法（CD）分析二级结构,表明α螺旋、β折叠含量分别为18.2%和47.7%,两种分析二级结构方法得到的结果基本一致。4、筛选基本营养物质、氨基酸、无机含S化合物、信号调控因子以及抗氧化剂5大类共14种物质测定其对GGT纯酶活性影响。结果显示：半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、精氨酸等多数氨基酸对GGT酶活性有激活作用；无机含硫化合物硫酸钠和亚硫酸钠均有一定的激活作用；Vc对GGT酶活性有一定的激活作用,而生物信号分子NO对GGT酶活性没有显著影响。采用半胱氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸、Vc、硫酸钠刺激香菇子实体,发现其中甲醛含量和GGT酶活性有很直接的相关性,推测可以通过调控香菇子实体内GGT酶活性达到控制甲醛的形成。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 香菇的营养价值和经济价值
• 1.1.1 香菇的营养价值及保健功效
• 1.1.2香菇的经济价值
• 1.2 香菇内生甲醛的研究进展
• 1.2.1 甲醛的性质与危害
• 1.2.2 香菇中甲醛的来源
• 1.2.3 香菇中内生甲醛形成机理的研究进展
• 1.3 γ-谷氨酰转肽酶的研究进展
• 1.3.1 GGT的蛋白结构
• 1.3.2 GGT催化特性
• 1.3.3 GGT活性的测定方法
• 1.4 本课题研究的背景、意义及研究内容
• 1.4.1 研究的背景和意义
• 1.4.2 研究内容
• 第2章 香菇子实体GGT酶的提取
• 引言
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原料处理
• 2.2.2 GGT活性测定及其得率计算方法
• 2.2.3 最佳提取方法的初步选择
• 2.2.4 超声辅助提取法提取GGT的研究
• 2.3 统计分析
• 2.4 实验结果与讨论
• 2.4.1 对硝基苯胺标准曲线
• 2.4.2 三种提取方法的比较
• 2.4.3 超声辅助提取法提取GGT的研究
• 2.5 本章小结
• 第3章 香菇GGT的分离纯化研究
• 引言
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 蛋白质浓度的测定
• 3.2.2 GGT活性的测定
• 3.2.3 GGT粗酶液的制备
• 3.2.4 硫酸铵分级沉淀
• 3.2.5 Phenyl Sepharose FF柱层析
• 3.2.6 Sephadex G-25柱脱盐
• 3.2.7 SDS-PAGE电泳
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 蛋白浓度标准曲线
• 3.3.2 硫酸铵分级沉淀
• 3.3.3 Phenyl Sepharose FF柱层析
• 3.3.4 Sephadex G-25浓缩脱盐
• 3.3.5 SDS聚丙酰胺凝胶电泳
• 3.3.6 HPLC检测纯度
• 3.3.7 分离纯化效率
• 3.4 本章小结
• 第4章 香菇GGT的酶学性质及结构研究
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 酶的最适反应温度
• 4.2.2 酶的最适pH值
• 4.2.3 不同反应时间对酶活性的影响
• 4.2.4 温度对酶稳定性的影响
• 4.2.5 金属离子对酶活性的影响
• 4.2.6 酶催化γ-glutamyl-P-nitroanilide水解反应的动力学
• 4.2.7 氨基酸含量分析
• 4.2.8 酶分子等电点的测定
• 4.2.9 酶分子二级结构的研究
• 4.3 实验结果与讨论
• 4.3.1 酶的最适反应温度
• 4.3.2 酶的最适pH值
• 4.3.3 不同反应时间对酶活性的影响
• 4.3.4 温度对酶稳定性的影响
• 4.3.5 金属离子对酶活性的影响
• 4.3.6 酶催化水解γ-glutamyl-P-nitroanilide的动力学
• 4.3.7 氨基酸含量分析
• 4.3.8 酶分子等电点的测定
• 4.3.9 酶分子二级结构研究
• 4.4 本章小结
• 第5章 香菇GGT活性和甲醛代谢关系的研究
• 引言
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 不同物质对GGT酶活性的影响
• 5.2.2 香菇子实体内GGT酶活性和甲醛代谢关系研究
• 5.3 实验结果与讨论
• 5.3.1 基本营养物质对香菇GGT活性的影响
• 5.3.2 不同氨基酸对香菇GGT活性的影响
• 5.3.3 无机含S化合物对香菇GGT活性的影响
• 5.3.4 NO、Vc对香菇GGT活性的影响
• 5.4 香菇子实体内GGT酶活性和甲醛代谢关系研究
• 5.5 本章小结
• 第6章 本研究结论、创新点和展望
• 6.1 总结
• 6.2 创新点
• 6.3 存在问题及展望
• 参考文献
• 附录一 研究生期间发表的论文
• 致谢