长梗木霉外切纤维素酶基因的克隆及其表达

论文摘要

本研究对一株纤维素酶高产菌株XST1进行ITS分子标记鉴定,接着克隆了该菌的两个外切纤维素酶基因cbhⅠ和cbhⅡ,进一步实现了外切纤维素酶基因在毕赤酵母中的有效表达。外切纤维素酶基因的克隆及其表达,丰富了现有的纤维素酶基因资源,也为该基因的进一步改造奠定了初步的分子基础。主要的研究内容和成果包括:（1） XST1菌株的分子鉴定:克隆并测定XST1菌株的ITS序列,通过比对和聚类分析,构建系统进化树,结果表明该菌株与长梗木霉（Trichodermalongibrachiatum）亲缘关系最为紧密,初步鉴定为长梗木霉。（2）外切纤维素酶的基因组DNA和cDNA的克隆及序列分析:提取XST1的基因组DNA和总RNA,参照里氏木霉和绿色木霉相关基因序列设计引物,采用PCR和RT-PCR技术分别扩增了外切纤维素酶Ⅰ、Ⅱ的全长基因序列和cDNA序列。序列分析结果表明:cbhⅠ基因长1681 bp,含2个内含子（462-527 bp和1226-1294 bp）;cbhⅡ基因全长1583 bp,含3个内含子（93-143 bp、528-583bp和832-894 bp）。（3）基因工程菌的构建:将cbh-cDNA序列插入表达载体pPIC3.5K,通过电击转化的方式导入毕赤酵母GS115菌株。重组菌株经0.5%甲醇诱导培养,实现了外切纤维素酶蛋白的分泌表达。SDS-PAGE分析表明,表达的酶蛋白分子量约为65kDa和67kDa左右。CMC检测平板中出现透明水解圈,工程菌发酵上清液水解CMC的最大酶活分别为26.40 U/mL和24.70 U/mL,水解pNPC的最大酶活分别为28.89 U/L和26.39 U/L。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 目录
• 绪论
• 引言
• 一 纤维素酶概述
• 1 纤维素简介
• 2 纤维素酶的生态分布
• 3 纤维素酶的分类
• 4 纤维素酶的结构域
• 5 真菌纤维素酶的基因及表达研究进展
• 6 纤维素酶的应用
• 7 纤维素酶研究中存在的问题
• 二 毕赤酵母表达系统综述
• 1 毕赤酵母表达宿主菌
• 2 表达载体及其整合方式
• 3 外源基因在毕赤酵母中高效表达的策略
• 三 本研究的主要内容和意义
• 第一章 纤维素酶产生菌XST1的分子鉴定
• 第一节 材料与方法
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶与试剂
• 1.3 常用培养基和缓冲液
• 1.4 PCR扩增用寡聚核昔酸引物
• 1.5 常用仪器
• 1.6 菌丝体总DNA的制备
• 1.7 XST1菌株ITS基因的克隆
• 1.8 目的基因的连接
• 1.9 转化
• 1.10 阳性克隆子的筛选
• 1.11 序列分析和进化树构建
• 第二节 结果与讨论
• 2.1 XST1的形态学观察
• 2.2 菌丝体总DNA的制备
• 2.3 XST1菌株ITS基因的克隆
• 2.4 阳性克隆子的筛选
• 2.5 序列分析和进化树构建
• 第三节 本章小结
• 第二章 长梗木霉XST1外切纤维素酶基因的克隆
• 第一节 材料与方法
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶和实验试剂
• 1.3 RNA提取用品
• 1.4 培养基
• 1.5 XST1菌株总RNA的提取
• 1.6 反转录获得cDNA
• 1.7 外切纤维素酶基因的克隆
• 第二节 结果与讨论
• 2.1 XST1菌株总RNA的提取
• 2.2 反转录获得cDNA
• 2.3 外切纤维素酶基因的克隆
• 第三节 本章小结
• 第三章 长梗木霉XST1外切纤维素酶基因在毕赤酵母中的表达
• 第一节 材料与方法
• 1.1 菌种和载体
• 1.2 工具酶和实验试剂
• 1.3 常用培养基和缓冲液
• 1.4 酵母表达培养基
• 1.5 cbh基因表达载体的构建
• 1.6 重组表达载体的线性化
• 1.7 重组表达载体的电转化
• 1.8 酵母重组子的筛选
• 1.9 重组毕赤酵母细胞的培养和诱导表达
• 1.10 表达产物的酶活检测
• 1.11 胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测
• 第二节 结果与讨论
• 2.1 cbh Ⅰ基因表达载体的构建及验证
• 2.2 cbh Ⅱ基因表达载体的构建及验证
• 2.3 重组载体的线性化
• 2.4 重组载体的转化和筛选
• 2.5 表达产物的酶活检测
• 2.6 胞外蛋白表达情况的SDS-PAGE检测
• 第三节 小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历