牛GPR54基因5’调控区的SNPs及其启动子效率研究

论文摘要

本研究将GPR54基因作为牛早熟性状的候选基因，以本地黄牛、西门塔尔牛、荷斯坦牛以及皖北牛育种群等为试验群体，通过对牛GPR54基因5’调控区序列进行分析，以研究5’调控区的多态性、启动效率及其与牛早熟性状的关联性。实验提取牛耳组织或血液基因组后，利用PCR技术克隆了GPR54基因5’调控区长度973bp的片段（GPR973），通过序列测定、SNP分型、生物信息学预测分析、双荧光素酶报告基因验证以及方差分析等方法对牛GPR54基因5’调控区GPR973序列进行了功能研究。结果表明：1. GPR973序列与山羊和人相应序列的同源性分别为93%和43%；启动子分析表明GPR973距CDS起点上游110bp-160bp和744bp-794bp处存在2个潜在的启动子区域，110bp处的启动子序列内存在一个TATA框。2. GPR973序列存在Sox-5、SRY、Mat1-M、Dfd、GATA-2、c-Myb、NIT2、STRE、 MZF1、MyoD、MATa1、cap、Dof2、GCR1、Poly A、GATA-1、AP-4、STATx和ADR1等多种潜在调控元件。3.在GPR973序列中检测到两个SNP位点，分别是距离CDS起点上游第754位的T→C突变（T754C）和起点上游第816位的C→T突变（C816T）。在C816T位点，PCR产物经MaeⅡ酶切出现3种基因型：C816C（157bp和184bp片段）、T816T（341bp片段）和C816T；在T754C位点，PCR产物经NlaⅣ酶切形成T754T（218bp和123bp片段）、 C754C（341bp片段）和T754C3种基因型。在皖北牛育种群体中，联合2个位点出现4种基因型：C816CT754T、C816TT754C、T816TC754C和C816CT754C，基因型频率分别为0.5431、0.4310、0.0172和0.0086，而在西门塔尔牛、荷斯坦牛和安徽地方黄牛只发现1种基因型，分别为C816CT754T和T816TC754C。4.双荧光素酶报告基因验证不同GPR973基因型在真核细胞中的启动子效率表明，带有GPR973-816CT754启动子的萤火虫与海肾荧光素酶荧光强度之比显著高于GPR973-816TC754启动子，效率提高79.31%（p<0.01）。5.关联分析显示，816CC754TT基因型牛的初情期比816TT754CC基因型牛的初情期提前了1.28月，可见GPR54基因的变异与牛早熟性具有一定的关联性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 试验对象
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 溶液配制
• 2.1.4 菌株及载体
• 2.1.5 仪器设备
• 2.1.6 分析工具软件
• 2.2 牛 DNA 的提取及检测
• 2.2.1 牛基因组 DNA 的提取
• 2.2.2 DNA 浓度和纯度的检测
• 2.3 引物设计和 PCR 扩增及检测
• 2.3.1 引物设计
• 2.3.2 最佳 PCR 扩增体系
• 2.3.3 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 RFLP 分析
• 2.5 牛 GPR54 基因 5’端序列克隆和测序
• 2.5.1 PCR 产物的快速纯化
• 2.5.2 双酶切反应
• 2.5.3 双酶切产物的纯化
• 2.5.4 感受态细胞的制备---氯化钙法
• 2.5.5 PCR 产物与载体连接
• 2.5.6 转化
• 2.5.7 质粒 DNA 的小量提取----试剂盒法
• 2.5.8 重组质粒的鉴定
• 2.6 报告基因
• 2.6.1 293T 细胞培养及传代
• 2.6.2 细胞铺板及细胞转染
• 2.6.3 细胞转染效率检测
• 2.7 数据分析
• 2.7.1 基因型频率
• 2.7.2 基因频率
• 2.7.3 基因位点 Hardy-Weinberg 平衡状态的检验
• 2.7.4 杂合度
• 2.7.5 有效等位基因数
• 2.7.6 多态信息含量
• 2.7.7 方差分析
• 3 结果与分析
• 3.1 DNA 提取
• 3.2 目的片段的同源性分析
• 3.3 目的片段转录因子绑定位点分析
• 3.4 牛 GPR54 基因 5’侧翼区的 SNP
• 3.5 C816T 和 T754C 在牛群中的分布
• 3.6 SNP 位点的群体特性参数
• 3.7 变异对转录因子结合位点的影响
• 3.8 GPR973 的启动子效率比较
• 3.9 GPR973 变异与牛初情期的关联性
• 4 讨论
• 4.1 GPR54 基因 5’侧翼区的多态性
• 4.2 启动子和 GC 岛甲基化与 GPR54 基因的转录表达
• 4.3 潜在转录因子与 GPR54 基因的转录表达
• 4.4 影响实验技术和研究方法的因素
• 4.4.1 PCR 引物
• 4.4.2 PCR 反应
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介