Sup35-Vip3A融合蛋白纳米线的制备及苏云金芽胞杆菌CT-43基因组的分析

论文摘要

1. Sup35-Vip3A融合蛋白纳米线的制备-营养期杀虫蛋白（Vip）是苏云金芽胞杆菌（Bt）在营养生长期分泌的一类杀虫蛋白,与依赖芽胞而形成的杀虫晶体蛋白不同,它从对数期即开始表达,一直持续到芽胞期。属于Vip3A类的Vip3Aa对甜菜夜蛾和小地老虎具有很高的毒力活性。Sup35是酿酒酵母的翻译终止因子,其朊蛋白结构域在体内外能形成淀粉样蛋白纤维。Sup35朊蛋白结构域自组装成纳米线的能力在生物技术和纳米材料等方面已得到广泛的应用。本研究将Sup351-61片段分别与营养期杀虫蛋白Vip3Aa和连接有小分子荧光检测标签——四半胱氨酸标签（tetracysteine tag, TC tag）的营养期杀虫蛋白Vip3Aa融合。实验表明,融合Sup351-61片段与营养期杀虫蛋白Vip3Aa后,可使Vip3Aa蛋白自组装成蛋白纳米线。Vip3Aa高浓度地展示在纳米线表面后能否提高其杀虫活性以及Vip3Aa在昆虫体内的消化过程正在研究中。2.苏云金芽胞杆菌CT-43基因组的分析苏云金芽胞杆菌中华亚种CT-43对鳞翅目和双翅目昆虫具有较高的毒性。它可以形成Cry1Aa3、CrylBa1、CrylIal4、Cry2Aa9和Cry2Abl多种伴胞晶体。在发酵过程中,CT-43菌株可同时分泌营养期杀虫蛋白Vip3Aal0以及杀虫核苷酸类似物苏云金素。本研究根据CT-43菌株的基因组注释结果,将与转录因子、Sigma因子、噬菌体、转座子、插入序列和芽胞形成相关基因进行了归类与分析。同时,利用生物信息学方法从CT-43菌株的基因间隔区预测出258个假定的sRNA （small RNA）,并对其中的25个sRNA的二级结构及其上下游的操纵子进行了初步分析。这些工作为进一步研究CT-43菌株代谢调控机制奠定了一定的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一部分 Sup35-Vip3A融合蛋白纳米线的制备
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白Vip
• 1.1.1 营养期杀虫蛋白Vip3的杀虫活性
• 1.1.2 营养期杀虫蛋白Vip3A的杀虫机制
• 1.1.3 营养期杀虫蛋白Vip的应用前景
• 1.1.3.1 vip基因重组微生物
• 1.1.3.2 转vip3基因植物
• 1.1.3.3 新的杀虫活性物质的筛选
• 1.2 酿酒酵母Sup35朊蛋白结构域的自组装机理
• 1.2.1 淀粉样蛋白概述
• 1.2.2 Sup35的朊蛋白结构域
• 1.2.3 Sup35朊蛋白结构域的自组装机理
• 1.2.3.1 自组装的基本过程
• 1.2.3.2 单体的寡聚化
• 1.2.3.3 成核与纤维的生长
• 1.2.4 Sup35淀粉样蛋白纤维的功能化
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 培养基及抗生素
• 3.1.3 试剂与器材
• 3.1.3.1 酶与主要试剂
• 3.1.3.2 主要仪器
• 3.1.4 溶剂与缓冲溶液
• 3.1.4.1 柱层析缓冲液
• 3.1.4.2 SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 酿酒酵母菌基因组DNA提取
• 3.2.2 苏云金芽胞杆菌YBT-1520基因组DNA提取
• 3.2.3 大肠杆菌质粒的提取
• 3.2.4 Sup35朊蛋白结构域基因的PCR扩增
• 3.2.5 大肠杆菌杆菌感受态细胞的制备及转化
• 3.2.6 重组质粒的筛选与验证
• 3.2.6.1 菌液PCR的模板制备
• 3.2.6.2 菌液PCR筛选阳性克隆
• 3.2.7 表达基因的扩增
• 3.2.7.1 Vip3Aa基因的PCR扩增
• 3.2.7.2 Vip3Aa-TC基因的PCR扩增
• 3.2.8 目的基因的诱导表达纯化
• 3.2.8.1 高表达菌株的筛选
• 3.2.8.2 高效表达条件的研究
• 3.2.8.3 Sup35-Vip3Aa和Sup35-Vip3Aa-TC的大量表达
• 3.2.8.4 目的蛋白的纯化
• 3.2.9 目的蛋白透析
• 3.2.10 蛋白质浓度的测定
• 3.2.11 目的蛋白自主装成纳米线
• 3.2.12 透射电镜表征
• 4 结果与分析
• 4.1 表达载体的构建
• 4.1.1 中间载体pET28b（+）-sup35的构建
• 4.1.2 表达载体的构建
• 4.1.2.1 表达载体pET28b（+）-sup35-Vip3Aa的构建
• 4.1.2.2 表达载体pET28b（+）-sup35-Vip3Aa-TC的构建
• 4.2 高效表达条件的确定
• 4.3 Sup35-Vip3Aa和Sup35-Vip3Aa-TC的大量表达纯化
• 4.4 透射电镜表征
• 5 讨论
• 6 结论
• 第二部分 苏云金芽胞杆菌CT-43基因组的分析
• 1 前言
• 1.1 蜡状芽胞杆菌群基因组学
• 1.2 原核生物中具有调节功能的非编码RNA
• 1.3 原核生物转座因子
• 1.4 原核生物sigma因子
• 1.5 苏云金芽胞杆菌研究
• 1.6 芽胞形成及调控
• 1.6.1 芽胞形成的起始
• 1.6.2 细胞不对称分裂和前芽胞形成
• 1.6.3 基因的区室化表达和芽胞内吞
• 1.6.4 芽胞的成熟及萌发
• 1.7 苏云金芽胞杆菌B.thuringiensis CT-43基因组学
• 2 本研究的目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 实验数据
• 3.2 基因预测与功能注释
• 3.3 sRNA的预测、二级结构分析
• 3.4 基因序列的分析
• 4 结果与分析
• 4.1 CT-43基因组中的sRNA
• 4.2 CT-43转录因子
• 4.3 CT-43噬菌体、转座子、插入序列
• 4.4 CT-43基因组中σ因子
• 4.5 CT-43芽胞萌发和芽胞形成相关基因
• 5 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间已经发表或即将发表的论文