论文摘要
植物化感作用是指一个活体植物通过向环境中释放其产生的某些次生化学物质,从而影响周围其他植物（包括微生物）的生长和发育一种化学生态学现象。利用水稻化感作用防除稻田杂草是当前农业生态学研究的热点问题之一,有望成为21世纪生物安全除草的关键技术。以往研究在水稻化感作用的供体、受体的遗传学特性、生理特性等生物学特性及化感物质的分离鉴定方面做了大量工作,取得了显著进展。已有研究表明,化感作用是一种易受环境调控的数量性状,但环境调控下化感作用潜力的变化仍是一个有争议的话题。营养胁迫是生产实践中较为突出的问题,为此本文采用国际公认的化感水稻PI312777和非化感水稻Lemont研究了氮素胁迫下水稻化感作用变化的分子机制,以期为分子手段调控化感作用潜力、化感物质的分离与鉴定提供依据。首先,为了区分化感作用与资源竞争,我们提出了ACS生物测试法,并利用ACS评价了低氮条件下化感水稻的化感作用潜力,运用发根力实验与根尖细胞形态学显微结构观察,拟探明化感水稻和非化感水稻在不同氮素条件下的水培液对稗草根尖生长的影响。结果表明:在营养资源正常偏丰富的条件下,因PI312777的生物干扰（资源竞争+化感作用）,导致对伴生稗草的抑制率分别为26.34%～29.14%和38.54%～44.58%,两因素差异明显,即表现化感作用大于资源竞争。而在同一条件下,因Lemont的资源竞争和化感作用导致对共生稗草的抑制率分别为3.27%～6.10%和9.45%～13.05%,两者差异不明显,即在该条件下Lemont的资源竞争和化感作用能力均较弱。这是同一生态位的生物在资源充足条件下竞争能力趋于弱化的表现。然而在低N胁迫下,因PI312777的资源竞争和化感作用导致对共生稗草的抑制率分别为22.51%和54.16%,因Lemont的资源竞争和化感作用导致对共生稗草的抑制率分别为63.61%和3.53%。由此可见,在资源有限时,PI312777不但有较强的资源竞争能力,而且化感抑草能力明显增强。Lemont则表现化感抑草能力下降,资源竞争能力却明显增强的趋势,最终导致其对伴生稗草的抑制率增加（47.99%）。表明低N胁迫引起Lemont对伴生稗草抑制率提高与其资源竞争能力提高有关。这是由于Lemont与共生稗草属相同的营养生态位,在资源短缺条件下竞争能力得到强化的结果。化感物质主要影响稗草根尖根冠细胞的生长。化感作用是多种化感物质协同作用的结果,涉及到多个酶及其之间的互作,以往的研究较多从生理生化水平研究单个的酶或蛋白质,差异蛋白质组学研究可以从系统学的角度研究化感作用所涉及的所有相关酶和蛋白质。为此本文运用差异蛋白质组学技术研究了化感水稻和非化感水稻根系在不同N水平下的蛋白质表达差异,以探明化感作用潜力相关的酶蛋白。差异蛋白质组学研究表明不同氮浓度下培养水稻由于氮效应而引起的蛋白质表达差异共有21个,其中PI312777有12个蛋白质表达丰度发生了变化,3个蛋白质点表达丰度下降的趋势。它们分别是ATP合成相关的蛋白质、与信号转导相关的蛋白质以及与核酸合成相关的蛋白质,9个蛋白质表达丰度随氮浓度的降低而呈现上升趋势,它们包括与化感物质合成相关的蛋白质、植物抗毒素相关的蛋白质、酚类合成相关的蛋白质以及与信号转导和基因表达调控等相关的一些蛋白质。Lemont总共有9个蛋白质表达丰度发生变化,其中5个蛋白质点表达丰度随着氮浓度的降低而呈现下降的趋势,它们包括了与化感物质合成相关、细胞分裂相关、生长调节相关、脂肪酸合成相关及光密度等相关、多胺合成相关的蛋白质。4个蛋白质的表达丰度随氮浓度的下降而呈现上升趋势,它们包括ATP合成相关、酚类合成相关、萜类降解相关的蛋白质。这表明低氮胁迫下化感水稻表现为营养代谢的整体下调和抗性蛋白的大量增加,其中包括酚酸合成相关的蛋白质表现上调,非化感水稻表现为抗性相关蛋白下调,而营养代谢相关蛋白大量上调。酚酸作为植物的逆境防御物质已被众多实验证明,本研究也表明低氮胁迫下化感水稻与非化感水稻体内酚酸合成相关蛋白均上调,但数量不同,化感水稻中检测到4个,非化感水稻中检测到2个,这一方面体现了其作为环境应力的功能,但另一方面化感水稻上调的酚酸更多,暗示着酚酸可能与化感作用特性相关。大量研究表明酚酸是化感物质,差异蛋白质组学研究结果显示:低氮能诱导化感水稻与非化感水稻体内酚酸合成相关的蛋白质本文差异蛋白质组学分析也表明低氮胁迫下酚酸合成相关酶表达增强,但分子生物学技术都存在一定的假阳性,差异蛋白质组学也不例外,它可能由于某些蛋白质的浓度过低或者匹配率不高而忽略某些差异蛋白质点,因而为进一步证实低氮胁迫下水稻酚酸代谢的变化,本文运用FQ-PCR分析了酚类代谢主要途径—苯丙烷代谢途径所涉及的9个相关酶基因的表达差异,从RNA水平上研究化感水稻和非化感水稻在低氮胁迫下酚酸类代谢关键酶的表达差异。结果表明化感水稻和非化感水稻根部酚酸类物质相关的9个酶对低氮胁迫的响应存在差异,化感水稻根部在低氮下其表达全部上调,而非化感水稻只有PAL和肉桂酰CoA基因表达轻微上调,两个水稻品种其叶部酚酸类代谢相关酶基因也呈现相同的趋势,这暗示在低氮胁迫下化感水稻酚酸类代谢相关基因表达增强,水稻根、叶及根系分泌物中酚酸的HPLC检测结果也表明,低氮下化感水稻根、叶和根系分泌物中都含有较多的酚酸,同比非化感水稻没有明显变化,无论正常氮还是低氮水平下化感水稻都较非化感水稻分泌更多的酚酸,低氮下的差异尤其明显,其中水杨酸（SA）是所检测的10种酚酸中含量差异最大。这表明低氮胁迫下酚酸类物质是主要的化感物质之一。也有学者认酚酸在土壤中易被微生物代谢,浓度难以达到毒理水平,不可能是主要的化感物质,从而提出了萜类的作用浓度极低,是主要化感物质的观点,本文也运用FQ-PCR技术分析了萜类代谢相关的酶基因,以揭示低氮胁迫下化感水稻和非化感水稻体内萜类代谢相关的酶基因表达方式的差异,探明低氮条件下萜类是否为主要的化感物质。研究表明:供氮条件从高向低改变,化感与非化感水稻的12个与萜类代谢关键酶基因有11个基因的表达行为（上调或下调）相同,只有异戊烯转移酶基因（prenyltransferase）表达方式相反,表明低氮下胁迫下化感水稻和非化感水稻萜类合成相关酶基因的响应机制相同,萜类不是低氮条件下化感水稻产生的主要化感物质。众所周知,植物根系分泌物数量和种类的差异会引起根圈土壤微生态环境和微生物功能群的差异。可见,低氮胁迫下化感水稻酚酸类代谢增强,酚酸类物质分泌增多,进一步地,在土壤微生物的趋化作用下,其必将导致微生物功能群结构的差异。由此本章拟研究不同氮肥供应下水稻根圈土壤微生物群落结构差异,旨在揭示酚酸类化感物质对土壤微生物的趋化作用。根系微生物的T-RFLP研究表明:在所检测到的175个T-RFs中,属于品种差异的只有16个,由氮素和品种引起微生物的垂直分布的差异和微生物峰度的差异是主要的。总体而言,低氮条件下水稻的根圈微生物较正常氮水平下丰富,相同氮条件下,化感水稻较非化感水稻丰富。化感水稻根际微生物群落组成呈现较大的多样性,与正常氮水平下化感水稻以及非化感水稻的根际微生物相反,低氮条件下化感水稻的根系微生物多于0-5cm层的微生物,同时其0-5cm和5-20cm层的微生物也较其它样品丰富。氮素引起的化感水稻根圈土壤微生物差异包括氮循环相关的细菌,产酸和嗜酸相关的细菌如产丙酸菌等和嗜酸硫杆菌属等、产外毒素相关的梭杆菌属,信号转导和防御相关的螺旋体属,以及一些病害相关的病原菌如植原体属,支原体属、克雷伯氏菌属等的一些细菌。这可能与低氮下化感水稻分泌较多的酚酸类化感物质,为微生物提供了更充分的C源,营造了异质的土壤微生态环境有关。综上所述,本文提出了一种新的生物测试法,区分了化感作用与资源竞争,解决了国际上一直存在争议的理论问题,为更加合理的评价化感作用提供了基础;进一步本文利用差异蛋白质组学、FQ-PCR、T-RFLP、HPLC等多种分子生物学技术系统的研究了低氮条件下化感水稻根部蛋白质的差异表达、酚酸和萜类代谢途径中相关酶基因的差异表达、植株体内和根系分泌物中化感物质浓度,从不同的分子水平阐明了低氮下水稻化感作用潜力增强与酚酸类物质代谢增强有关,低氮条件下酚酸是水稻主要的化感物质之一,在土壤微生物的趋化作用下,低氮条件下化感水稻的根圈微生物群落结构呈现较大多样性,其中包括产酸菌、嗜酸菌和酚酸降解菌,同时也进一步证实了低氮条件下化感水稻营造了异质的微生态环境。多种分子生物学方法的联合运用有效避免了单一方法的”假阳性”,同时从不同分子水平探讨低氮下化感水稻作用潜力增强的分子机理具有系统性,是对前人生理生化水平研究的补充,证明了化感作用是一个可以被调控的性状,也从分子水平为化感物质的分离与鉴定、遗传育种提供了参考。