论文摘要
华山新麦草（Psathyrostachys huashanica Keng. 2n=14,NsNs）是仅分布在秦岭山脉华山段的中国特有农作物野生近缘种,具有抗寒、耐旱、耐瘠薄、抗病、品质优良等优异性状。本研究采用同源克隆法从华山新麦草基因组DNA中分离克隆LMW-GS和α-醇溶蛋白基因并对其进行序列结构分析;构建了LMW-GS和α-醇溶蛋白基因的原核表达载体,并在大肠杆菌体外表达系统中诱导表达融合蛋白;同时对华山新麦草LMW-GS和α-醇溶蛋白基因进行了系统进化分析。主要结果如下:1、采用同源克隆法,从华山新麦草基因组DNA中克隆了7个LMW-GS基因:LG-Ns-5 （ HM475144 ）、LG-Ns-6 （ HM475145 ）、LG-Ns-7 （ HM475146 ）、LG-Ns-8（HM475147）、LG-Ns-9（HM475148）、LG-Ns-10（HM475149）和LG-Ns-11（HM475150）。序列分析表明,这7个基因序列均具有LMW-GS基因的典型结构特点和基本特征,含有8或9个半胱氨酸残基,序列LG-Ns-6（HM475145）和LG-Ns-7（HM475146）具有完整的编码区,其余5个基因的编码区内含有1或2个提前终止密码子,推测为假基因。基因LG-Ns-6和LG-Ns-7的二级结构分析显示,这2条序列在N-末端区和重复区含有无规则卷曲,C-末端区不仅富含无规则卷曲,还含有α-螺旋和β-折叠结构。系统进化分析显示,华山新麦草LMW-GS基因序列被聚为2类,说明Ns基因组LMW-GS基因在系统进化过程中发生了分化,两个亚位点的分歧时间约为7.30百万年;华山新麦草Ns基因组LMW-GS基因与小麦、山羊草等亲缘物种LMW-GS基因的分化时间大约为12.72百万年;华山新麦草LMW-GS基因与柔软赖草LMW-GS基因的分化大约发生在4.83百万年前。华山新麦草的LMW-GS基因与柔软赖草的LMW-GS基因具有相对较近的亲缘关系。根据华山新麦草LMW-GS基因LG-Ns-7（HM475146）成熟蛋白的完整编码区和表达载体pET-28a（+）的结构区,构建了融合表达载体pET28a-Glu-Ns,SDS-PAGE和Western-blot结果显示,获得的融合蛋白的分子量与理论值（39kD）相符,表明融合表达载体pET28a-Glu-Ns可在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中成功地诱导表达。2、对已经获得的4条华山新麦草α-醇溶蛋白基因的序列分析表明,这4个基因序列具有α-醇溶蛋白家族的一般结构模型和基本特征,含有8或9个半胱氨酸残基,序列GQ139526和GQ139527在重复区和多聚谷氨酰胺Ⅱ区具有特殊的结构变异;系统进化分析表明,序列FJ713595和GQ139525与柔软赖草和纤毛鹅观草的α-醇溶蛋白基因具有相对较近的亲缘关系,序列GQ139526和GQ139527单独成一类,其可能为α-醇溶蛋白基因家族中的新类型;分子进化分析显示,基因FJ713595与其它Ns基因组α-醇溶蛋白基因的分化时间大约为12.05百万年;基因GQ139526和GQ139527与柔软赖草α-醇溶蛋白基因HQ416920和HQ416921的分化发生的较晚,大约在2.66百万年前。将华山新麦草α-醇溶蛋白基因GQ139527（Gli-Ns-5）与原核表达载体pET-28a（+）构建了融合表达载体pET28a-Gli-Ns,SDS-PAGE和Western-blot分析显示,融合表达载体pET28a-Gli-Ns可成功地在大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中实现表达,并获得与理论值（37.5 kD）相符的融合蛋白,表明重组质粒pET28a-Gli-Ns能够在大肠杆菌BL21（DE3） pLysS中实现特异性表达。华山新麦草麦LMW-GS基因的定向克隆与序列结构的生物信息学分析,以及华山新麦草麦LMW-GS和α-醇溶蛋白基因的原核表达、系统进化分析与分化时间估算,为揭示该类型基因品质效应的分子基础奠定了理论依据、为探讨Ns基因组的遗传变异及进化特征提供了参考,并为小麦品质改良提供了新的候选基因。