福氏志贺菌和沙门氏菌渗透调节周质葡聚糖基因功能的研究

论文摘要

基因mdoB、mdoC、mdoD、mdoG和mdoH是与渗透调节周质葡聚糖的合成密切相关的几个重要基因。本研究以福氏志贺菌2457T野生型为出发菌株,利用λ-Red系统重组技术,构建了福氏志贺菌2457T的mdoB、mdoC、mdoD、mdoG、mdoH以及mdoGH的缺陷型突变体,研究了这些基因在渗透调节周质葡聚糖合成中的功能以及培养基中渗透压对渗透调节周质葡聚糖合成的影响;分离、提取并纯化了渗透调节周质葡聚糖,测定了葡聚糖的组成和取代基,分析了葡聚糖内各单糖的连接方式。此外,还研究了福氏志贺菌2457T野生型及渗透调节周质葡聚糖合成缺陷型opgB、opgC、opgD、opgG、opgH和opgGH突变体、沙门氏菌SL1344及其渗透调节周质葡聚糖合成缺陷型opgGH突变体在标准培养基和洗菜水中的生长及生物膜的产生能力;测定了福氏志贺菌2457T及其突变体对人类结肠癌细胞（Caco-2细胞）的毒力,检测了福氏志贺菌2457T及其突变体的耐药性、抗热击能力、抗酸碱度能力等。本研究主要获得以下结果:（1）本试验使用λ-Red系统,分别成功地敲除了福氏志贺菌2457T染色体上的mdoB、mdoC、mdoD、mdoG、mdoH和mdoGH基因,获得了6株缺陷型突变体,为研究它们在福氏志贺菌2457T渗透调节周质葡聚糖合成中的功能奠定了基础;（2）本试验成功提取并纯化了福氏志贺菌、沙门氏菌和大肠杆菌的渗透调节周质葡聚糖,研究了渗透调节周质葡聚糖的性质,定量测定了福氏志贺菌opgB、opgC和opgD突变体及野生型中渗透调节周质葡聚糖的磷酸取代基和琥珀酸取代基,并对带有不同电荷的渗透调节周质葡聚糖进行了鉴别;（3）确定了基因mdoB、mdoC、mdoD、mdoG和mdoH在合成渗透调节周质葡聚糖中的功能,明确了渗透压对渗透调节周质葡聚糖产量的影响,证明了基因mdoG、mdoH和mdoGH的缺失导致福氏志贺菌突变体不能合成渗透调节周质葡聚糖;（4）研究了渗透压对福氏志贺菌2457T及其6株渗透调节周质葡聚糖合成缺陷型突变体、沙门氏菌SL1344及其渗透调节周质葡聚糖合成缺陷型opgGH突变体生长的影响,结果显示将低营养培养基的渗透压提高到正常水平时,福氏志贺菌2457T和沙门氏菌SL1344及其突变体对数生长期提前;沙门氏菌野生型在洗菜水中得到的生长曲线比福氏志贺菌野生型生长曲线稳定;（5）测定了福氏志贺菌2457T和沙门氏菌SL1344及其突变体在不同的洗菜水中生物膜的产量,研究了生物膜产生的规律,沙门氏菌SL1344尽管在洗菜水中生长良好,但只在菠菜水和芹菜水中产生生物膜;沙门氏菌突变体opgGH在所有洗菜水中都不产生生物膜;福氏志贺菌2457T野生型和突变体仅在白菜水中产生了大量的生物膜。提高渗透压后,对各种菌株在不同洗菜水中产生生物膜的影响并不明显;（6）检测了福氏志贺菌2457T及其渗透调节周质葡聚糖合成缺陷突变体对Caco-2细胞的毒力,证明野生型和突变体感染Caco-2细胞的能力没有明显的差异;（7）研究了福氏志贺菌2457T及其渗透调节周质葡聚糖合成缺陷型突变体的抗热击性和抗药性,以及在含0.5% SDS的培养基和在不同pH值条件下的生长状况,其中基因mdoD缺陷型抗热击能力最明显;0.5% SDS可抑制所有菌株在1/8LBNS培养基中的生长;突变体opgGH得以生长的pH值范围明显大于其它突变体及野生型的pH值范围。

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摘要

ABSTRACT

第一章前言

1.1 渗透调节周质葡聚糖研究的背景及现状

1.1.1 渗透调节周质葡聚糖的结构

1.1.2 渗透调节周质葡聚糖的生物合成

1.1.3 渗透调节周质葡聚糖取代基

1.1.4 渗透调节周质葡聚糖的生物功能

1.2 福氏志贺菌和沙门氏菌致病性

1.2.1 福氏志贺菌

1.2.2 沙门氏菌

1.3 λ-Red 重组系统

1.3.1 Red 重组系统的组成

1.3.2 Red 重组的机制

1.3.3 Red 重组系统在微生物基因敲除中的应用

1.4 试验目的与研究内容

第二章福氏志贺菌2457T 渗透调节周质葡聚糖合成基因缺陷型突变体构建

2.1 试验材料与设备

2.1.1 试验菌株

2.1.2 试验主要试剂与仪器设备

2.2 试验内容与方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 质粒制备

2.2.3 pKD3 质粒扩增

2.2.4 DNA 提取与纯化

2.2.5 Dpn1 酶消化

2.2.6 DNA 片段纯化

2.2.7 制备感受细胞

2.2.8 电转化

2.2.9 突变体筛选

2.2.10 毒力检测

2.2.11 PCR 验证

2.2.12 福氏志贺菌突变体目的基因上下游片段测序分析

2.2.13 互补菌株的制备

2.3 结果与分析

2.3.1 凝胶图片分析

2.3.2 opgGH 突变体互补菌株pLL3 的检验结果

2.3.3 突变体测序结果分析

2.3.4 突变体毒力质粒检测

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章福氏志贺菌2457T 及其突变体渗透调节周质葡聚糖的提取及分析

3.1 试验材料与设备

3.1.1 试验菌株

3.1.2 试验主要试剂

3.1.3 试验主要仪器

3.2 试验内容与方法

3.2.1 菌株培养

3.2.2 渗透压测量

3.2.3 糖测定方法

3.2.4 渗透调节周质葡聚糖的提取

3.2.5 渗透调节周质葡聚糖的纯化

3.2.6 蛋白质测定

3.2.7 菌数测定

3.2.8 琥珀酸测定

3.2.9 糖基组成及糖苷键连接测定

3.2.10 渗透调节周质葡聚糖极性分析

3.2.11 NaOH 水解

3.2.12 数据处理

3.3 结果与分析

3.3.1 分离胶选择

3.3.2 野生型福氏志贺菌2457T 渗透调节周质葡聚糖的分离

3.3.3 大肠杆菌及沙门氏菌标准株渗透调节周质葡聚糖的分离

3.3.4 福氏志贺菌及沙门氏菌、大肠杆菌标准株渗透调节周质葡聚糖糖基组成分析

3.3.5 福氏志贺菌渗透调节周质葡聚糖糖基内化学结构分析

3.3.6 福氏志贺菌及其突变体渗透调节周质葡聚糖的分离纯化

3.3.7 福氏志贺菌渗透调节周质葡聚糖糖基连接基团分析

3.3.8 渗透压对福氏志贺菌及其突变体渗透调节周质葡聚糖产量的影响

3.3.9 渗透压对福氏志贺菌野生型及其突变体单位蛋白量及菌数的影响

3.3.10 福氏志贺菌及其突变体渗透调节周质葡聚糖的极性分析

3.3.11 福氏志贺菌opgGH 突变体的产渗透调节周质葡聚糖功能互补试验

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章福氏志贺菌和沙门氏菌及突变体生长特性研究

4.1 试验材料与设备

4.1.1 试验菌株

4.1.2 试验主要试剂

4.1.3 试验主要仪器

4.2 试验内容与方法

4.2.1 菌株培养

4.2.2 洗菜水制备

4.2.3 生长曲线测定

4.2.4 生长膜测定

4.3 结果与分析

4.3.1 福氏志贺菌和沙门氏菌生长试验培养基选择

4.3.2 福氏志贺菌和沙门氏菌野生型及突变体在标准培养基中的生长情况

4.3.3 福氏志贺菌和沙门氏菌野生型及其突变体在低渗低营养条件下的生长情况

4.3.4 福氏志贺菌和沙门氏菌野生型及其突变体在低营养条件下的生长情况

4.3.5 低营养条件下渗透压对福氏志贺菌和沙门氏菌野生型及其突变体生长的影响

4.3.6 渗透压对福氏志贺菌野生型、opgGH 突变体及其互补菌株pLL3 生长的影响

4.3.7 福氏志贺菌和沙门氏菌野生型与opgGH 突变体竞争性生长的研究

4.3.8 福氏志贺菌和沙门氏菌野生型与突变体在洗菜水中生长的研究

4.3.9 福氏志贺菌野生型与突变体生物膜形成研究

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章福氏志贺菌野生型及突变体体外毒力及抗性试验

5.1 试验材料与设备

5.1.1 试验菌株

5.1.2 试验主要试剂

5.1.3 试验主要仪器

5.2 试验内容与方法

5.2.1 菌株培养

5.2.2 体外毒力试验

5.2.3 热击试验

5.2.4 酸碱度影响试验

5.2.5 十二烷基硫酸钠（SDS）抑制试验

5.2.6 最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）试验

5.3 结果与分析

5.3.1 细菌体外毒力试验

5.3.2 热击对福氏志贺菌野生型生长的影响

5.3.3 热击对福氏志贺菌突变体生长的影响

5.3.4 pH 值对福氏志贺菌野生型生长的影响

5.3.5 pH 值对福氏志贺菌突变体生长的影响

5.3.6 抗生素对福氏志贺菌野生型及突变体的抑菌效果

5.3.7 十二烷基硫酸钠（SDS）对福氏志贺菌野生型及opgGH 突变体生长的影响

5.4 讨论

5.5 本章小结

第六章结论与创新点

6.1 结论

6.2 创新点

参考文献

缩略词

致谢

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