四种氨基酸在不同环境条件下氧化损伤评价的研究

论文摘要

正常生理条件下,生物体新陈代谢过程中会产生过氧化氢、羟基自由基等氧化活性物质（Reactive Oxygen Species, ROS）。若体内存在大量的活性氧化物质或者机体的抗氧化机能下降,会造成氧化系统和抗氧化系统的失衡,产生氧化应激（Oxidative Stress）。ROS在体内会与组成蛋白质的氨基酸发生直接或间接相互作用,改变蛋白质的结构与构象而引起蛋白质损伤,从而影响蛋白质的功能表达,引起一系列的疾病。因此,氧化应激致蛋白质氧化损伤生物标记物的研究和检测方法的探索,将有助于人们了解氧化应激导致蛋白质氧化损伤的机理,可以应用于相应疾病的预防和治疗,也有助于相关药物的开发。本论文主要利用电化学技术研究了酪氨酸在电极上的氧化行为和利用液相色谱-质谱联用技术,研究了血管紧张素和肌红蛋白在羟基自由基作用下的氧化损伤程度和氧化损伤位点,确定了酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸在不同环境条件下的氧化损伤情况,并建立了其氧化损伤的评价方法。论文主要包括以下三个部分：第一部分：利用电化学循环伏安法研究了酪氨酸在玻碳电极上的电化学行为。结果表明,酪氨酸循环伏安响应谱图的阳极支上呈现出单独的一个氧化峰,峰电位位于0.90V附近,而在其阴极支上并无相应的还原峰出现,从而我们认为酪氨酸在玻碳电极上的电化学氧化损伤反应是不可逆的。本部分还研究了酪氨酸在玻碳电极上电化学行为的影响因素。从除氧的结果中可以得出,除氧后的酪氨酸溶液氧化峰电位较未除氧的负移,并且电流增大,溶解氧对实验存在明显影响；随着扫描次数的增加,其伏安响应曲线上酪氨酸氧化峰的峰电流逐渐减小,说明此过程中伴随着电活性质粒的弱吸附现象；酪氨酸氧化峰电流与扫描速度的平方根成线性关系,相关系数达到0.9982；随着pH增大,酪氨酸溶液的氧化峰电位呈负移趋势,氧化峰电流整体呈下降趋势；随着温度增加,氧化峰电位负移,峰电流增加；酪氨酸浓度对氧化峰电位的影响不大,但是随着酪氨酸浓度的增加,氧化峰电流呈增大的趋势。第二部分：利用液相色谱-质谱联用技术,研究了血管紧张素AngⅠ、Ⅱ、Ⅲ在Fenton反应产生的羟基自由基作用下的氧化损伤程度及位点。试验结果表明,随着血管紧张素与羟基自由基作用时间的增长,其受到的氧化损伤程度增强。作用时间分别为0、2、4、8、16min时,AngⅠ的氧化损伤程度为0、1.73、1.93、4.29、4.88（%）；AngⅡ为0、2.16、2、17、3.03、5.42（%）；AngⅢ为0、1.45、1.82、3.33、5.52（%）；质谱实验结果表明,在三种血管紧张素中,酪氨酸和苯丙氨酸均受到羟基自由基的氧化。我们可以利用这种羟基自由基对血管紧张素的特定氧化产物作为ROS致血管紧张素氧化损伤的生物标记物。第三部分：利用液相色谱-质谱联用技术,对γ射线照射后的肌红蛋白的氧化损伤程度及位点做了研究。试验结果表明,随着γ照射剂量的增加,肌红蛋白氧化损伤的程度有明显增加的趋势。以蛋白酶解产物V17EADIAGHGQEVLIR31为例,在Y射线照射剂量为0,10,20,40,100Gy下,其氧化损伤的程度为0%、3.8%、8.3%、13.4%、20.9%；由质谱结果,我们可以得到,在γ射线的照射下,肌红蛋白的两个甲硫氨酸和两个异亮氨酸被氧化。我们可以利用肌红蛋白氧化损伤产物作为肌红蛋白氧化损伤位点和损伤程度的生物标记物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 蛋白质的组成、结构及生物功能
• 1.2.1 蛋白质的组成
• 1.2.2 蛋白质的结构
• 1.2.2.1 蛋白质的一级结构
• 1.2.2.2 蛋白质的二级机构
• 1.2.2.3 蛋白质的三级结构
• 1.2.2.4 蛋白质的四级结构
• 1.2.3 蛋白质的生物功能
• 1.3 氧化应激
• 1.3.1 氧化应激和抗氧化防御机制
• 1.3.2 激发氧化应激的环境因素
• 1.3.2.1 活性氧化物
• 1.3.2.2 重金属
• 1.3.2.3 电离辐射
• 1.3.2.4 紫外照射
• 1.3.2.5 化学试剂
• 1.3.3 蛋白质氧化损伤的类型
• 1.3.3.1 氨基酸侧链修饰
• 1.3.3.2 肽链断裂
• 1.3.3.3 蛋白质的交联聚合
• 1.3.3.4 蛋白质构象的改变
• 1.3.4 蛋白质氧化损伤及疾病
• 1.3.4.1 衰老
• 1.3.4.2 糖尿病
• 1.3.4.3 动脉粥硬化
• 1.3.4.4 神经系统疾病
• 1.4 蛋白质氧化损伤的分析和评价技术
• 1.4.1 蛋白质氧化损伤生物标记物
• 1.4.2 蛋白质分离技术
• 1.4.2.1 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.4.2.2 液相色谱
• 1.4.2.3 毛细管电泳
• 1.4.3 蛋白质氧化损伤的鉴定技术
• 1.4.3.1 Edman降解法
• 1.4.3.2 电化学
• 1.4.3.3 质谱
• 1.4.3.4 蛋白质芯片
• 1.5 论文的研究目的和研究内容
• 1.5.1 本论文的研究目的
• 1.5.2 本论文的研究内容
• 第二章 酪氨酸电氧化损伤的研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 实验试剂
• 2.2.3 电极的预处理
• 2.2.4 试验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 磷酸盐缓冲溶液浓度的选择
• 2.3.2 研究体系的循环伏安特征
• 2.3.3 溶解氧、扫描次数、扫描速率、pH、温度、酪氨酸浓度对氧化还原过程的影响
• 2.3.3.1 溶解氧的影响
• 2.3.3.2 扫描次数的影响
• 2.3.3.3 扫描速率的影响
• 2.3.3.4 pH的影响
• 2.3.3.5 温度的影响
• 2.3.3.6 Tyr浓度的影响
• 2.4 结论
• 第三章 羟基自由基作用下血管紧张素氧化损伤的研究
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验仪器
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 实验步骤
• 3.2.3.2 检测手段
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 多肽氧化损伤程度的测量
• 3.3.2 氧化损伤位点的测量
• 3.3.2.1 Ang Ⅲ的氧化损伤位点
• 3.3.2.2 Ang Ⅱ的氧化损伤位点
• 3.3.2.3 Ang Ⅰ的氧化损伤位点
• 3.4 结论
• 第四章 γ射线作用下肌红蛋白氧化损伤的研究
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验试剂
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 肌红蛋白的氧化损伤
• 4.2.3.2 肌红蛋白的酶解及检测
• 4.2.3.3 肌红蛋白氧化损伤产物的定性与定量分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 肌红蛋白酶解产物分析以及氧化损伤标记物的分离鉴定
• 4.3.2 肌红蛋白氧化损伤位点的确定
• 4.4 结论
• 第五章 主要结论和研究展望
• 5.1 主要结论
• 5.1.1 关于酪氨酸电化学行为及影响因素
• 5.1.1.1 酪氨酸的电化学行为
• 5.1.1.2 影响酪氨酸电化学行为的因素
• 5.1.2 关于羟基自由基作用下血管紧张素氧化损伤的研究
• 5.1.2.1 血管紧张素的氧化损伤程度
• 5.1.2.2 管紧张素氧化位点的确定
• 5.1.3 关于γ射线作用下肌红蛋白氧化损伤的研究
• 5.1.3.1 肌红蛋白受不同剂量γ射线照射后的损伤程度
• 5.1.3.2 肌红蛋白氧化损伤位点的确定
• 5.2 工作展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间已发表的论文
• 攻读硕士学位期间获得的奖励
• 参与的科研项目
• 学位论文评阅及答辩情况表