小麦叶片枯草杆菌类蛋白酶TaSSP1基因片段的重组表达和纯化及其多克隆抗体的制备

论文摘要

本实验室多年以来一直致力于小麦植物叶片衰老过程中蛋白水解同工酶变化的研究,在早期检测到的多种与衰老相关的内肽酶同工酶中,存在一种性质较为稳定蛋白酶,实验室前期已经得到该蛋白酶的纯品,并对该酶进行了生化特性和一级结构的质谱鉴定,确定其是一种新发现的枯草杆菌类丝氨酸型蛋白酶TaSSP1（Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Proteasel）,同时结合生物信息学方法,与NCBI上数据比对,初步明确了该蛋白酶的基因序列。为了能够从蛋白水平上进一步研究该蛋白酶的生理生化功能及细胞定位等科学问题,需要制备出该蛋白酶的多克隆抗体,然后利用制备出的多克隆抗体研究上述问题,进而解析该蛋白酶在植物叶片衰老过程中的作用机理。由于该蛋白酶在天然小麦叶片中的丰度较低,直接从小麦叶片中提取该蛋白酶作为抗原制备多克隆抗体的工作量太大,因此,克隆其具有较好抗原性肽链片段对应的基因片段（TaSSP1-f, Triticum aestivum Subtilisin-like Serine Protease1-fragment）,共718bp,并利用原核表达系统表达出其重组蛋白作为抗原是较好的方法,也是现今较为常用的方法。实验前期,董强通过提取小麦衰老叶片总RNA,根据NCBI上已有mRNA序列信息设计引物,利用RT-PCR技术获得了TaSSP1-f抗原编码基因TaSSP1-f,并将该基因连接到原核表达载体pET30a上,成功构建了pET30a-TaSSP1-f重组表达载体；本研究在此基础上将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta （DE3）中进行IPTG诱导表达,经过IPTG诱导表达后的蛋白经SDS-PAGE电泳检测,显示插入了TaSSP1-f表达载体的大肠杆菌Rosetta （DE3）表达出了带有His标签的融合目的蛋白TaSSP1-f,其主要以包涵体形式存在,其最佳的诱导表达条件为：诱导温度37℃,时间4h, IPTG浓度为1.0mM,大肠杆菌菌液的起始诱导OD600值为0.5。上述包涵体经过洗涤之后溶于8M Urea中,免疫兔子前将其进行SDS-PAGE,切下含有目的蛋白的胶条加入液氮中研磨成粉末状,然后加入PBS提取缓冲液4℃过夜提取目的蛋白,SDS-PAGE验证提取的目的蛋白,凝胶上出现唯一的蛋白条带即可将提取的目的蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔。免疫前将目的蛋白稀释至2mg/mL,以1：1的比例与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合乳化,第一次免疫用弗氏完全佐剂,之后均用弗氏不完全佐剂,每次免疫量为1mL乳化液,间隔周期为2个周,免疫2个半月后心脏取血,获得效价为1：4的抗血清。Western-blot实验结果表明,此多克隆抗血清不仅能与抗原蛋白特异性结合,还可以和经过SDS-PAGE分离的小麦叶片中TaSSP1蛋白酶特异性结合,进一步研究显示,小麦叶片中TaSSP1蛋白酶的含量和活性在暗诱导衰老过程中都有明显增加。因此,该多克隆抗血清可以用于今后TaSSP1蛋白酶的后续研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词对照表
• 文献综述
• 一、植物蛋白水解酶研究进展
• 1.1 蛋白水解酶的分类
• 1.2 与植物衰老相关的蛋白水解酶的研究进展
• 1.2.1 半胱氨酸蛋白酶与植物衰老
• 1.2.2 丝氨酸蛋白酶与植物衰老
• 1.2.3 其他蛋白酶与植物衰老
• 二、植物SUBTILASE家族丝氨酸蛋白酶研究进展
• 2.1 植物丝氨酸蛋白酶简述
• 2.2 植物枯草杆菌类蛋白酶简述
• 2.3 植物SUBTILASE家族丝氨酸蛋白酶研究技术和方法
• 2.3.1 明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Gelation-SDS-PAGE）定性分析
• 2.3.2 紫外分光光度计法或荧光分光度计法定量分析
• 2.3.3 质谱鉴定
• 2.3.4 重组表达
• 2.3.5 在细菌表达系统中的表达
• 2.3.6 Western-blot
• 三、研究目的和意义
• 第一章 重组TASSP1-F蛋白的表达与纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株与载体
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 溶液配置
• 1.1.5 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 原核重组表达载体pET30a-TaSSP1-f的转化
• 1.2.2 DNA序列的测定
• 1.2.3 所用生物信息学软件
• 1.2.4 带有His标签重组蛋白的诱导表达及检测
• 1.2.5 TaSSP1-f重组蛋白诱导表达条件的优化
• 1.2.6 TaSSP1-f重组蛋白在菌体中的主要存在形式的判定
• 1.2.7 可溶性目的蛋白和包涵体的纯化
• 2 结果与分析
• 2.1 pET30a-TaSSP1-f质粒的鉴定
• 2.2 TaSSP1-f蛋白诱导条件优化表达及可溶性分析
• 2.3 可溶性目的蛋白和包涵体的纯化
• 3 小结
• 4 讨论
• 第二章 TASSP1-F的多克隆抗体制备及其应用检测
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 动物材料
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 抗原
• 1.1.4 主要试剂
• 1.1.5 溶液配置
• 1.1.6 仪器
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 免疫方法
• 1.2.2 琼脂双扩散实验方法
• 1.2.3 分离血清
• 1.2.4 叶片暗诱导衰老处理
• 1.2.5 粗酶液的提取
• 1.2.6 蛋白酶明胶-SDS-聚丙烯酰胺凝胶活性电泳
• 1.2.7 蛋白酶Western-blot检测
• 1.2.8 SDS-PAGE测定蛋白酶的分子量
• 2 结果与分析
• 2.1 多克隆抗体的特异性分析
• 2.2 SDS-PAGE测定蛋白质的分子最
• 2.3 暗诱导衰老叶片中蛋白酶Western-blot检测及明胶-SDS-PAGE活性分析
• 3 小结
• 4 讨论
• 全文结论
• 创新之处
• 存在问题和展望
• 参考文献
• 致谢