论文摘要
目前大规模高密度养殖造成的水环境污染,致使水产病害日趋严重,特别是病毒性疾病造成的损失更加惊人。淋巴囊肿病毒（Lymphocystis disease virus,LCDV）,属于虹彩病毒科（Iridoviridae）,是我国海水养殖鱼中大规模暴发的首例病毒。已知至少有42科、125种以上的鱼可被淋巴囊肿病毒感染,其中海水鱼占30科。国外报道蝶鲆类发病较多,这些鱼通常为经济鱼种,淋巴囊肿病的流行给该产业带来了巨大的损失。目前,对病毒性感染疾病尚无特效药物,在人类中通常是利用疫苗进行预防接种或干扰病毒复制的药物及抗生素对症治疗,而干扰病毒复制的药物常常给宿主带来危害。水产养殖者大多使用抗生素类药,易造成抗生素药物的积累、破坏生态平衡、诱变抗药菌株、污染水体,还导致了我国水产品的出口受阻。据观察,淋巴囊肿病毒感染有自限性,即疾病存在自愈现象。牙鲆出现自愈的主要表现在体表无肿瘤,病毒检测为阴性。牙鲆自愈现象与温度有密切的关系,一般在14℃或低于14℃时,肿瘤增长较慢;随水温的升高,18℃左右,肿瘤生长较陕,发病情况严重;但水温达到24以上,牙鲆身上的肿瘤脱落,病鱼出现自愈。通常认为,在低温下,鱼类的先天免疫成份的活性较大;在高温下,鱼类的适应性免疫如淋巴细胞活性和抗体活性变高。鱼类显示出季节影响的对病原体的敏感性。这无论是对于病原体的流行,还是宿主的敏感性增加是非常重要的。关于淋巴囊肿病的自愈机理从未见研究报道,但如果搞清这一问题、可能会给该病的防治提供思路。细胞因子与病毒的清除有密切关系,尤其是免疫相关因子,它们的表达可干扰病毒在体内的复制、组装和分泌,因此本论文以淋巴囊肿病的自愈机理为内容,从机体抗病因子和功能基因为切入点,利用real-time PCR技术探讨其免疫防御机理;同时,利用双向电泳技术,对牙鲆在自愈过程中血清蛋白质出现的变化,寻找差异表达的蛋白,为进一步探索鱼类淋巴囊肿病自愈的原因寻找依据。以期找到治愈疾病的关键因素,为水产养殖中的疾病防治提供有价值的参考。本论文的主要成果如下:1.利用PCR技术,对自愈牙鲆的各组织进行LCDV-cn的检测,结果显示自愈后的牙鲆在脾、肾、鳃、心脏、肠、肌肉、血液、表皮、体表粘夜、卵巢、脑和肝脏中都不含有病毒。说明自愈后牙鲆体内没有病毒。2.组织病理切片显示肝脏PAS染色结果,自愈组比患病组着色深,说明患病牙鲆肝脏由于LCDV-cn的感染而受损,糖原合成功能降低。肿瘤的AB-PAS染色结果,可见肿瘤细胞外层呈现蓝色、为酸性物质。初步分化的幼稚肿瘤细胞中,核仁非常发达、在某些细胞核中还出现了2-3个核仁,在某些细胞中核变成了哑铃状;肿瘤的AB-PAS染色结果目前还未见报道。3.利用real-time PCR技术,试验温度分别设置为14℃,18℃,22℃和26℃,对正常对照组和患病牙鲆组肝、脾、头肾中IL-1,TNF,TNFR,IL-8,IL-8R,Mx的表达研究结果表明:在肝脏中,实验组IL-1的表达随温度的升高而增加,22℃达到峰值,是标准对照组的3.8倍,（P＜0.05）;对照组在22℃表达上升,增高1.9倍;在脾、头肾中,IL-1的表达随温度的升高而升高,在26℃达到峰值,分别为10.8和13.9倍（P＜0.05）。肝、脾中的Mx的表达均随温度的升高明显增加,26℃时与标准对照相比,增加到31.1和26.5倍（P＜0.05）;只有头肾中在22℃达就达到峰值,为42.1倍:在对照组,随温度升高,Mx的表达虽有增加,但最高是肾脏在26℃的表达,增高仅为2.1倍。实验组肝脏TNF在22℃时表达最高,是标准对照组的8.51倍（P＜0.05）;脾和头肾中的表达,无论是对照组还是实验组,均随温度的升高表达增加。实验组的肝、脾和头肾中,在22℃时,TNFR的表达都达到最高,分别为标准对照组的22.1、4.87和21.55倍（P值均＜0.05）。试验组肝脏和肾脏中IL-8在22℃表达量最高,分别为标准对照组的25.7和1.67倍（P＜0.05）,而脾脏中IL-8在18℃即达到峰值,为标准对照组的3.31倍（P＜0.05）.对照组的脾、肾组与其他温度相比,在18℃也达到最大表达量（P＜0.05）。试验组脾和头肾中IL-8R的表达在26℃最高,为标准对照组的4.5和5.6倍,（P＜0.05）,肝脏中的IL-8R的表达量在22℃时最大,为9.73倍（P＜0.05）:对照组肝脾中的表达在22℃最高为2.5和4.1倍（P＜0.05）,头肾中在26℃最高,为2.6倍（P＜0.05）。这些数据显示随着水温的升高,细胞因子在实验组的不同组织内表达明显升高,在对照组表达升高不是很明显。由于这些细胞因子涉及到牙鲆的非特异性免疫,它们表达增强,说明高温下牙鲆的非特异性免疫力增强,也说明,随着水温的升高,牙鲆清除病毒的能力增强,使其自愈成为可能。4.本实验应用real-time PCR技术检测了MHCⅠα、MHCⅡα和TCR在疫苗接种后不同时间以及不同温度下表达水平的变化。在肝脏中,MHCⅠα、MHCⅡα和TCR峰值分别在22℃,26℃,22℃,增高倍数分别为14.03,16.33,10.6倍;在脾脏中MHCⅠα、MHCⅡα和TCR峰值分别在18℃,26℃,26℃,增高倍数分别为2.11,16.87,2.89倍;在头肾中MHCⅠα、MHCⅡα和TCR峰值分别在14℃,26℃,18℃,增高倍数分别为5.23,9.96,10.9倍。疫苗注射组,肝、脾、肾中MHCⅠα的表达第2天高于第8天:MHCⅡα的表达则相反,第8天高于第2天;TCR的表达无显著性差异。从结果我们可以看出,MHCⅡα和TCR的表达是温度依赖性的,随着水温的升高,表达量升高。MHCⅠ的表达峰值的温度相对较低。总体上来说,LCDV感染组MHCⅠα,MHCⅡα,TCR在不同组织的表达量要高于健康组。说明被感染的牙鲆处在-种较强的免疫应答状态。对于MHCⅠα和MHCⅡα在疫苗免疫后出现的应答不同,应该是它们不同的激活途径导致。目前普遍认为MHCⅠ类分子主要传递内源性抗原,而MHCⅡ分子主要传递外源性抗原。但部分内源性抗原也可以由MHCⅡ类分子传递,部分外源性抗原也可以由MHCⅠ类分子传递。可见MHCⅠ、Ⅱ类基因在表达上互相补充共同调节机体的免疫活动。所以,高温使MHC和TCR的高表达,有利于促进机体对病毒感染细胞的识别,增强细胞免疫和体液免疫,从而清除病毒。5.本实验利用双向电泳技术,对自愈牙鲆和患病牙鲆血清中表达的差异蛋白进行了鉴定。通过分析型上样,结果显示自愈组的蛋白点为328±30个点,患病组为315±21个点。自愈组有8个蛋白点表达上调,新增3个蛋白点,一个蛋白点下调;患病组新增两个蛋白点。制备型凝胶自愈组和病鱼组的血清蛋白图谱中分别分离198±33和301±41个点。对其中10个差异表达的蛋白质点,进行质谱分析后得到牙鲆补体C3和转铁蛋白。由于这两种物质是牙鲆主要的非特异性免疫因子。所以我们认为,非特异性免疫因子的高表达,是牙鲆自愈的主要因素之一。