论文摘要
目的:研究雌激素对急性脊髓损伤后脊髓组织BCL-2、BAX基因表达及细胞凋亡的影响。方法:140只成年雄性SD大鼠随机分为:空白组14只,损伤组42只,雌激素药物组42只和甲基强的松龙药物组42只,每组包括1h、4h、8h、1d、3d、5d、7d共7个时间点,空白组每点2只SD大鼠,其余组每点各有6只SD大鼠。按改良Allen’s撞击法致伤力为50gcf（10g×5cm）损伤T9-T10制作动物模型,大鼠用10%水合氯醛麻醉,无菌条件下以T9-T10为中心做后正中切口,咬除T9-T10棘突及椎板,空白组只暴露脊髓,不损伤脊髓,给予相同剂量生理盐水,损伤组术后30分钟经大鼠尾静脉给予等量生理盐水。雌激素药物组术后30分钟经大鼠尾静脉给予苯甲酸雌二醇[100ug/kg],每天一次,甲基强的松龙药物组术后30分钟经大鼠尾静脉给予静注大剂量甲基强的松龙（30mg/kg）,在各个亚组内至少有6只动物,不足的应及时补充。分别在各时间点处死动物,经心脏灌注取材,标本经梯度脱水,浸蜡,石蜡包埋,制成6微米厚切片,通过对SCI部位标本进行HE染色观察镜下损伤部位脊髓的病理形态,同时对受损脊髓部位进行免疫组织化学检测神经细胞凋亡因子BCL-2和BAX基因的表达及用原位末端标记法（TUNEL法）标记神经元凋亡细胞,观察雌激素、甲基强的松龙对大鼠SCI的神经保护作用。结果:⑴BCL-2在空白组各时间点均未见阳性细胞表达,损伤组和各药物治疗组（Table-3）在SCI伤后4h,损伤部位开始出现较明显的表达,伤后8h数量增加,伤后24h达高峰（BCL-2平均光密度值分别为:损伤组0.273±0.043 ;雌激素组0.396±0.052 ;甲强龙组0.395±0.057）,分布范围扩至周围正常组织,伤后3d开始有减少（BCL-2平均光密度值分别为:损伤组0.207±0.050;雌激素组0.308±0.046;甲强龙组0.301±0.041）,伤后1周基本上只有微弱的阳性表达。BCL-2阳性细胞胞质着黄色（Fig.10）,神经元和胶质细胞均有明显表达（Fig.11）。统计分析结果示雌激素组和甲基强的松龙组BCL-2蛋白表达（平均光密度值）比损伤组在相同时间点有明显差异（P<0.05）,雌激素组和甲基强的松龙组BCL-2蛋白表达在相同时间点无明显变化,无统计学意义（P>0.05）,各组内24h时间点较其它点BCL-2蛋白表达均有明显差异（P<0.05,Table-3）。⑵BAX在阴性对照切片上无表达,空白组有少量阳性表达,损伤组和各药物治疗组均在脊髓损伤伤后4h,损伤部位的阳性表达增加（Table-4）,伤后8h损伤部位的阳性细胞数明显增多,24h阳性表达达最高峰（BAX平均光密度值分别为:损伤组0.283±0.053;雌激素组0.194±0.047;甲强龙组0.191±0.046）,伤后3d表达开始减少（BAX平均光密度值分别为:损伤组0.191±0.078 ;雌激素组0.151±0.051 ;甲强龙组0.164±0.070）,伤后7d表达基本趋于伤前水平。BAX阳性细胞胞质着棕黄色（Fig-16）,灰质中神经元细胞,白质中胶质细胞均有大量阳性细胞表达。高倍镜下可见阳性细胞部分呈凋亡形态,阳性信号主要位于胞浆内。图象分析系统分析结果显示雌激素药物组较损伤组BAX蛋白表达明显减少,统计分析结果示雌激素组和甲基强的松龙组BAX蛋白表达比损伤组在同一时间点有明显差异（P<0.05）,雌激素组和甲基强的松龙组BAX蛋白表达在相同时间点无明显变化,无统计学意义（P>0.05）,各组内24h时间点较其它点BAX蛋白表达均有明显差异（P<0.05,Table-4）。⑶空白组零星可见TUNEL阳性细胞,损伤组及药物治疗组均可见大量TUNEL阳性细胞,灰质、白质内均可见,脊髓损伤后4h时阳性细胞较为稀疏,8h,1d和3d时阳性细胞较为稠密,图象分析系统分析结果显示,凋亡细胞的数量在各时间点有明显差异（P<0.05,Table-5）,8h时达高峰（损伤组31.5±5.0;雌激素组26.8±4.6;甲强龙组27.4±4.7单位:个/㎜ 2）,以后稍有下降,3d后即开始迅速下降（损伤组25.2±4.2;雌激素组20.3±5.8;甲强龙组20.9±3.1单位:个/㎜ 2）,7d时仍有少量凋亡细胞。图象分析系统分析结果显示雌激素药物组较损伤组细胞凋亡数明显降低,相关分析结果显示有明显差异（P<0.05）,雌激素组和甲基强的松龙组细胞凋亡数无明显变化,无统计学意义（P>0.05）。⑷BCL-2/BAX值在各时间点同样有明显差异（P<0.05,Table-6）,伤后8h和1d时较小,以后逐渐增大,5d和7d时趋于稳定。各数值结果显示BCL-2/BAX值在8h小时最小（损伤组0.954±0.172 ;雌激素组1.720±0.354 ;甲强龙组1.715±0.328）,此时凋亡的细胞数最多（损伤组31.5±5.0;雌激素组26.8±4.6;甲强龙组27.4±4.7单位:个/㎜ 2）,以后随着BCL-2/BAX值逐渐增大,细胞凋亡的数也逐渐下降（Table-7）,对于损伤组各时间点相关分析结果显示,BCL-2/BAX值与细胞凋亡数呈负相关（R=-0.79,P<0.01,有统计学意义Fig.32）。结论:凋亡是SCI后神经细胞死亡的一种重要方式,雌激素可以促进大鼠SCI后BCL-2基因表达,抑制BAX基因的表达,改变BCL-2/BAX的比值,从而抑制SCI后神经细胞的凋亡,对损伤脊髓的神经功能有保护作用,这可能是雌激素对SCI具有神经保护的分子机制之一,为雌激素应用于临床治疗SCI提供理论依据。
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