细胞毒活性的红树林内生真菌的分离筛选及其次生代谢产物研究

论文摘要

红树林内生真菌生存环境特殊复杂,其次级代谢产物结构新颖、种类繁多,是新结构活性化合物的重要来源。为了寻找结构新颖的活性化合物,本论文采用化学与生物学相集成的筛选方法,开展了红树林内生真菌的分离、细胞毒活性筛选及2株红树林内生真菌的次生代谢产物的研究工作。内容包括:红树林内生真菌的分离与细胞毒活性菌株的筛选;发酵菌株发酵条件的摸索及细胞毒活性成分的追踪分离;单体化合物的结构解析;单体化合物的细胞毒活性初步评价。从采自中国南海的海口、文昌、山口三个产地的33个红树林根茎样品中,分离纯化了173株内生真菌。并采用集成化学与细胞毒活性相结合的筛选方法,对这173株内生真菌的发酵产物同时进行了化学多样性及其细胞毒活性分析,发现能产生较好化学多样性次生代谢产物的菌株44株,对小鼠白血病细胞株P388有不同程度细胞毒活性的菌株35株,两者结合并通过HPLC指纹图谱分析,最终确定天才菌株（Talented Strains）7株。其中菌株WC13-1与HK13-8的次生代谢产物在用TLC和HPLC进行的化学分析评价时发现其都对FeCl3呈阳性反应,HK13-8在HPLC指纹图谱分析时有一主要峰,为主要活性组分;WC13-1在HPLC指纹图谱分析时呈现紫外吸收相似的系列吸收峰,表明存在系列结构类似物。选定这两株菌作为本论文的研究对象。在考察了目标菌株的培养条件后,对2株目标活性菌进行了大量发酵,得到发酵产物。采用薄层色谱,硅胶柱色谱,Sephadex LH-20柱色谱,反相高效液相色谱等分离手段,通过解析波谱数据并结合理化常数阐明了从红树林内生真菌—枝孢霉Cladosporium sp. WC13-1的发酵产物中分离鉴定了25个化合物:trans-2,3- dihydro-2-methyl-4-methoxybenzopyran-5-ol （1）, （2r,3cis,4trans）-2,3-dihydro-2- methylbenzopyran-3,4,5-triol （2）, （2R+2S）-7-O-α-D-ribofuranosyl-2,3-dihydro-5- hydroxy-2-methybenzopyran-4-one （3+4）, 7-O-α-D-ribofuranosyl-5-hydroxy-2- propylbenzopyran-4-one （5）, methyl 3S-（2,3-dihydroxyphenyloxy）butyrate （6）, 3S- （2,3-dihydroxyphenyloxy） butanoic acid （7）, （E, threo）-hepta-4,6-dien-2,3-diol （8）,（3E,8E,6S）-undeca-3,8,10-trien-1,6-diol （9）, trans-2,3-dihydro-2-methylbenzopyran- 4,5-diol （10）, （±）-2,3-di hydro-5-hydroxy-2-methyl-4H-1-benzopyran-4-one （11）, （±）-5,7-dihydroxy-2-methylchroman-4-one （12）, 1-（2,6-dihydroxyphenyl）butan-1- one （13）, 1-（2,6-dihydroxylphenyl）propan-1-one （14）, 1-（2,6-dihydroxyphenyl） ethan-1-one （15）, N-（4-hydroxylphenethyl）acetamide （16）, 4-（2-hydroxyethyl） benzaldehyde （17）, cyclo-（Pro- Leu） （18）, cyclo-（Val-Pro） （19）, cyclo-（Pro-Ile） （20）, cyclo-（Tyr-Pro） （21）, cyclo-（Pro- Phe） （22）, 1-（3-indolyl）-2,3-dihydroxypropan-1-one （23）, butyrolactone I （24）, 2-butyryl-3,5-dihydroxycyclohex-2-en-l-one （25）;从Pencillium sp. HK13-8的发酵产物中分离鉴定了5个化合物:thymine （26）, uracil （27）, （22E,24R）-3β,5α,9α-trihydroxyergosta-7,22-dien-6-one （28）, ergosterol （29）, S-curvularin （30）。其中,酚性化合物1-7及不饱和脂肪醇8、9为新化合物。利用MTT法、SRB法,对分离获得的单体化合物的抗肿瘤活性进行了初步评价。结果表明:酚性大环内酯-弯胞霉素（30）具有中等程度的细胞毒活性,对HL-60细胞的IC50为2.56μM;酚性苯骈吡喃类新化合物1在100μM时对肿瘤细胞BEL7402和HL-60的抑制率分别为86.97%和71.17%,IC50分别为47.9和77.0μM。利用DPPH法对单体化合物的抗氧化活性进行了评价。结果表明:化合物1, 6-7, 10具有较强抗氧化活性,IC50分别为1.1, 0.6, 0.05, 1.2μg/ml。化合物12-15, 23具有较弱的抗氧化活性,IC50分布为20.7到71μg/ml之间。综上,本文采用集成筛选的方法获得海洋活性菌株,并阐明了2株红树林内生菌株发酵产物中的30个化合物的化学结构,获得新化合物9个,证明本方法是寻找结构新颖的先导化合物的有效手段。上述研究为抗肿瘤药物的研究提供了新化合物及资源菌株。

论文目录

• Abbreviations
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一章 红树植物内生真菌的分离和Talented Strains 筛选
• 第一节 集成筛选模型的建立
• 第二节 红树林内生真菌的分离及 Talented Strains 筛选
• 第三节 小结
• 第四节 实验部分
• 参考文献
• 第二章 天才菌株的发酵条件考查及活性次生代谢产物的分离
• 第一节 枝孢霉属真菌 Cladosporium sp.WC13-1 发酵条件的考查
• 第二节 内生真菌Cladosporium sp. WC13-1 活性代谢产物的提取分离
• 第三节 内生真菌Pencillium sp. HK13-8 活性成分的提取分离
• 第四节 小结与讨论
• 第五节 实验部分
• 参考文献
• 第三章 次生代谢产物的结构研究
• 第一节 单体化合物的结构解析
• 第二节 新化合物的生合成途径推测
• 第三节 小结与讨论
• 第四节 实验部分
• 参考文献
• 第四章 化合物的细胞毒活性测试
• 第一节 细胞毒活性测试方法
• 第二节 化合物活性测试结果
• 第三节 小结与讨论
• 第四节 实验部分
• 参考文献
• 第五章 综述—红树林内生真菌的分离与活性次生代谢产物研究新进展
• 结语与创新
• 个人简历及本论文相关研究成果
• 致谢
• 附图