利用自溶素Mbg在苏云金芽孢杆菌表面展示几丁质酶及其抗真菌性能的研究

论文摘要

几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的直链状高分子生物多聚体,它不但是无脊椎动物如昆虫、介虫和软体动物的主要结构成分,而且也是真菌细胞壁的主要组分之一。几丁质酶（Chitinase, EC3.2.1.14）是能够将几丁质降解为几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖的一种水解酶类,广泛存在于各种微生物、植物和动物细胞中,并参与多种生理生化过程。由于几丁质酶在植物病原真菌和植物病虫害的生物防治方面具有巨大的应用潜力,因此受到广泛的重视。目前关于细胞表面展示几丁质酶的研究鲜有报道。本文通过PCR技术分别从苏云金芽孢杆菌不同亚种菌株9602、YBT-1221和HD-73中扩增得到其几丁质酶编码基因chi,并进行了序列测定,最终选择了之前未见报道的苏云金芽孢杆菌9602菌株几丁质酶基因进行后续研究工作。序列分析结构表明,所扩增的基因chi9602为一个完整阅读框,由2031bp对组成,共编码676个氨基酸,理论分子量为74.5kDa。序列和结构比较分析表明,该基因的序列与GenBank中登记的9种几丁质酶编码基因序列的同源性均高达90%以上。保守结构域分析显示该基因所编码的蛋白质属于糖基水解酶第18家族,即几丁质酶,具有由分泌信号肽、N末端催化区、粘蛋白Ⅲ型区（Fn3D）及几丁质结合区（ChBD）组成的典型结构。将chi9602基因（不含信号肽）连接到大肠杆菌表达载体pTrcHis B的BglⅡ/PstⅠ位点,构建重组质粒pMB332,并转入大肠杆菌受体菌Top10中进行诱导表达,获得与理论分子量大小相符（70kDa）的表达产物。对在大肠杆菌中的诱导表达条件进行了优化研究,获得优化的表达条件为：IPTG诱导终浓度为1mmol/L,培养温度37℃,诱导时间6h。将大肠杆菌细胞优化表达的几丁质酶进行分离纯化,用于免疫新西兰大白兔,得到相应的具有较高效价的多克隆抗体。同时,对纯化的几丁质酶进行相关的酶学性质分析,结果显示,所纯化的几丁质酶的最适反应温度为37℃,最适反应pH为7.0,酶活为30.01U/ml。；而酶动力学研究结果表明该几丁质酶在以胶体几丁质为底物时的Km值为85.99mg/ml,Vmax值为18.28mg·ml-1·min-1。利用细菌细胞表面展示技术,以具有2个Mbg的N端重复结构单元作为锚定模体,分别将几丁质酶（Chi9602,不含信号肽）和几丁质酶催化域（Chi9602c）锚定于苏云金芽孢杆菌BMB171表面,同时用不依赖芽孢的cry3Aa启动子替换Mbg本身的启动子以增强融合蛋白的表达。通过Western blot分析、免疫荧光显微镜观察以及流式细胞仪分析证实了几丁质酶的细胞表面定位。全细胞酶活性测定显示表面展示工程菌株的全细胞几丁质酶活最高分别达到2.95U/mL和3.72U/mL,均明显高于宿主菌株BMB171。选择水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solania）作为供试植物病原真菌,用纯化的几丁质酶和构建的工程菌株分别进行真菌菌丝生长的抑制试验。结果发现,几丁质酶纯酶对于真菌菌丝的生长有较强的抑制作用,表面展示Chi9602的工程菌株对于植物病原真菌水稻纹枯病菌菌丝的生长表现出抑制作用,而表面展示Chi9602c的工程菌株虽然具有较高的几丁质酶水解活性,但是其仅仅表现出非常微弱的真菌菌丝生长的抑制作用。实验结果证实了几丁质酶Chi9602具有较高的几丁质酶活性和抗真菌活性。几丁质酶Chi9602的粘蛋白Ⅲ型区及几工质结合区结构对于几工质酶催化水解胶体几丁质的活性没有明显的影响,但是对于该几丁质酶的抗真菌活性具有重要的影响。有鉴于苏云金芽孢杆菌本身对于多种重要农业害虫具有特异杀虫活性,本研究所构建的苏云金芽孢杆菌表面展示几丁质酶工程菌株可望为植物病原真菌和农业害虫的生物防治提供了一种有效的、可再生和多功能应用的潜在途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 细菌表面展示技术研究进展
• 1.1.1 细菌表面展示技术简介
• 1.1.2 细菌表面展示系统的组成
• 1.1.3 细菌表面展示系统的种类
• 1.1.4 细菌表面展示技术的应用
• 1.1.5 细菌表面展示技术存在的问题与展望
• 1.2 运载蛋白-Mbg
• 1.3 乘客蛋白-几丁质酶的研究进展
• 1.3.1 几丁质酶的研究历史
• 1.3.2 几丁质酶的分布
• 1.3.3 几丁质酶的分类
• 1.3.4 几丁质酶的结构特征及理化性质
• 1.3.5 几丁质酶的应用
• 1.4 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 PCR反应的引物
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 技术路线
• 2.2.2 分子生物学基本操作
• 2.2.3 大肠杆菌诱导表达、纯化及蛋白质含量和酶活测定
• 2.2.4 几丁质酶活性影响因子的测定和动力学常数测定
• 2.2.5 融合蛋白在细菌细胞表面的定位分析
• 2.2.6 重组工程菌的性能分析
• 3 结果与分析
• 3.1 苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及序列分析
• 3.1.1 PCR扩增
• 3.1.2 序列的生物信息学分析
• 3.2 chi9602基因的原核表达、纯化以及几丁质酶活性的测定
• 3.2.1 原核表达载体的构建
• 3.2.2 几丁质酶的诱导表达
• 3.2.3 诱导表达条件的优化
• 3.2.4 几丁质酶的纯化、蛋白质含量以及几丁质酶活性的测定
• 3.2.5 几丁质酶影响因子分析
• 3.2.6 几丁质酶动力学常数测定
• 3.3 表面展示几丁质酶的苏云金芽孢杆菌工程菌的构建
• 3.3.1 表面展示载体的构建
• 3.3.2 细胞表面定位分析
• 3.4 表面展示几丁质酶的苏云金芽孢杆菌工程菌的性能分析
• 3.4.1 生长曲线的测定
• 3.4.2 重组菌株全细胞几丁质酶活性测定
• 3.4.3 纯化的几丁质酶和工程菌株抑制真菌的实验
• 4 讨论与小结
• 4.1 讨论
• 4.1.1 运载蛋白Mbg的性能分析和作用
• 4.1.2 靶蛋白几丁质酶的结构分析和在细菌表面展示效率的分析
• 4.1.3 工程菌株全细胞酶活分析
• 4.1.4 表面展示工程菌株的功能分析
• 4.2 小结
• 参考文献
• 附录
• 已发表或者待出版论文
• 致谢