论文摘要
蝎毒素是一类由一个由20-90个氨基酸构成的小分子多肽。这类小肽一般含3或4对二硫键,可以选择性地与动物可兴奋细胞膜上的钠、钾、钙、氯离子通道结合,影响离子通道的状态,成为研究离子通道生理作用和功能定位的重要工具之一。同时蝎毒素也是研究蛋白质结构和功能关系很好的模型。但是,由于天然纯蝎毒素蛋白获得比较困难,其结构和功能的研究及其应用都受到很大的限制。通过基因工程方法获得重组蝎毒素,可以比较容易获得高纯度的蝎毒素蛋白以便进行研究和应用。目前蝎毒素的表达主要还是利用大肠杆菌的原核表达系统,其具有缺少蛋白质翻译后加工机制、不易于二硫键的正确搭配、易形成包涵体等缺点。本实验的目的是克隆并表达东亚钳蝎抗癌止痛肽（AGAP）,获得AGAP成熟肽在毕赤酵母分泌型表达系统（pPIC9K）的高效表达,以期为制备活性重组通道毒素奠定基础。实验首先将东亚钳蝎抗癌止痛肽基因（AGAP）重组到分泌型酵母表达载体（pPIC9K）形成表达质粒pPIC9K-AGAP。考虑到在蛋白质信号加工过程中,毕赤酵母体系中的Ste13内肽酶切割效率不足,常常造成表达目的蛋白的N端多余氨基酸。因此利用中间载体pPIC6K,改造了表达载体pPIC9K中的内肽酶Ste13位点,构建了另一个表达载体pPIC9K-AGAP′。线性化质粒pPIC9K-AGAP电转酵母细胞GS115,KM71,SMD1168,利用G418抗性筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS电泳检测表达产物,经过350个克隆筛选获得了8株表达量较高的表达菌株。细胞上清中有特异蛋白条带,且在第四天表达量最高,表达产物单体分子量为7.2kb左右。线性化质粒pPIC9K-AGAP′电转酵母细胞GS115,经同样操作获得了1株表达量较高菌株。实验结果显示,利用分泌型毕赤酵母表达系统表达东亚钳蝎抗癌止痛肽（AGAP）在技术上可行,pPIC9K-AGAP重组质粒在甲醇营养型酵母菌中可经甲醇诱导产生的AGAP蛋白的定性分析仍在研究中。