P450芳香化酶在许氏平鮋繁殖生理中的作用研究

论文摘要

本论文以山东半岛许氏平触为研究对象,运用组织学、免疫组织化学、激素放射免疫测定方法以及分子生物学方法,对其性腺发育、血浆性类固醇激素含量两型芳香化酶基因序列及其基因组织表达进行了研究和分析,所得结果与结论如下：1许氏平触精巢的周年发育分期和精细胞变化许氏平触的精巢具有两个分支,两叶不对称,属于小叶型精巢。精子的发生经历初级精原细胞、次级精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子6个典型的发育阶段。从精巢发育的周年变化可以看出,其精巢发育与季节性繁殖活动同步。3-5月,精巢处于精原细胞增殖期。7月～11月进入精子发生期。次年1～3月是精子退化吸收期。2许氏平触血浆性类固醇激素水平的周年变化研究采用I125标记的放射免疫测定方法检测雄鱼和雌鱼的睾酮（T）、雌二醇（E2）和孕酮（P）的变化水平。研究发现：11月到次年3月繁殖期雌性许氏平触血浆的E2和P含量迅速增加,5月进入胚胎期开始显著下降（P<0.05）,至7～9月份进入休整期后E2和P降至全年最低。而T的含量在胚胎期显著上升（P<0.05）达到峰值。这些结果表明,雌性许氏平触繁殖期血浆中雌二醇水平的提高,满足了卵黄形成和积累的需要,促进了卵巢的成熟。T和P的含量与卵巢发育的相关性,提示它们是卵巢发育的一定阶段所必需的。雄性许氏平触血浆E2和P水平的周年变化规律,全年最高峰值出现在繁殖季节即11月～次年3月份,繁殖后开始显著下降（P<0.05）,至静止期降到到最低。而T含量较E2和P水平的周年变化滞后,在胚胎期达到峰值。这些结果表明,雄性许氏平触繁殖期睾酮维持在较高水平,促进精子的发生和形成。3许氏平触芳香化酶（P450arom）在性腺中的免疫组织化学研究芳香化酶在许氏平触卵巢发育的各个时期中都有免疫阳性反应。各时相卵母细胞的滤泡膜,胞质对芳香化酶都有免疫阳性反应,核仁呈阴性。胚胎中呈现强免疫阳性反应。精原细胞、精母细胞、精子细胞和细胞间质在各发育期精巢中有不同程度的芳香化酶免疫阳性反应存在,但精原细胞核仁及精子均呈免疫阴性反应。精小叶间质细胞和精小叶基膜呈免疫强阳性反应且反应阳性较强,但是支持细胞的免疫反应呈阴性。通过以上结果表明,芳香化酶在性腺发育和精细胞、卵细胞的增殖过程中起着重要生理作用,芳香化酶是雄激素向雌激素转化的关键酶和限速酶,芳香化酶的表达为证明性类固醇激素在性腺发育和成熟过程中的重要地位提供了证据。4许氏平鮋芳香化酶基因的克隆及表达分析采用同源克隆策略和RACE的方法,从许氏平鮋卵巢中分离了性腺型芳香化酶（P450aromA）。CYP19A cDNA全长P450arom A cDNA全长1868bp,编码516个氨基酸残基。半定量PCR分析表明：P450aromA的表达具有明显组织特异性,P450aromA只在性腺中表达,且卵巢中表达量远高于精巢。这些结果表明P450aromA参与了许氏平鮋的性腺发育和性别决定过程。克隆得到1109bp的CYP19B基因cDNA长片段,编码369个氨基酸。CYP19B在雌性许氏平鮋中表达较为广泛。在性腺和脑中均有表达,且脑中的表达明显高于性腺的表达。结果显示CYP19B参与许氏平鮋性腺发育和成熟,并可能参与神经系统的内分泌调节。进化树分析得出克隆得到的两种基因分别归于硬骨鱼类分支中的鱼类CYP19 A和CYP19B基因。与脑型芳香化酶最为相近的是舌齿鲈。与性腺型芳香化酶最为接近的是点带石斑鱼。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 鱼类精巢研究
• 2 鱼类芳香化酶基因
• 3 性类固醇激素的研究
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 许氏平鮋性腺精巢发育周年变化的组织学研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 2.1 精巢外观
• 2.2 精小叶结构
• 2.3 精巢不同发育阶段生殖细胞的形态学特点
• 2.4 精巢发育形态和组织学分期
• 2.5 雄性许氏平鮋肝重系数（HSI）、性成熟系数（GSI）、肥满度（CF）周年变化
• 3 讨论
• 3.1 许氏平鮋精巢类型和结构特点
• 3.2 许氏平鮋排精方式和精巢发育特点
• 3.3 许氏平鮋精巢发育过程中细胞的变化
• 3.4 氏平鮋精巢成熟系数和肝重指数的周年变化
• 4 小结
• 第三章 许氏平鮋血浆性类固醇激素水平的周年变化研究
• 1 材料与方法
• 2 放射免疫测定（RIA）方法的建立
• 3 结果
• 3.1 性成熟系数（GSI）、肝重系数（HSI）、肥满度（CF）周年期变化
• 2的周期变化'>3.2 雌性许氏平鮋血浆中E₂的周期变化
• 3.3 雌性许氏平鮋血浆中T的周期变化
• 3.4 雌性许氏平鮋血浆中P的周期变化
• 2的周期变化'>3.5 雄性许氏平鮋血浆中E₂的周期变化
• 3.6 雄性许氏平鮋血浆中T的周期变化
• 3.7 雄性许氏平鮋血浆中P的周期变化
• 4 讨论
• 2、T和P的周年变化'>4.1 雌性许氏平鮋血浆E₂、T和P的周年变化
• 2、T和P的周年变化'>4.2 雄性许氏平鮋血浆E₂、T和P的周年变化
• 5 小结
• 第四章 许氏平鮋性腺中芳香化酶的免疫组织化学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 芳香化酶在精巢及精细胞中的免疫组织化学
• 2.2 芳香化酶在卵巢及卵细胞中的免疫组织化学
• 3 讨论
• 3.1 芳香化酶与卵巢发育的关系
• 3.2 芳香化酶与精巢发育的关系
• 4 小结
• 第五章 许氏平鮋芳香化酶基因的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 2.1 许氏平鮋CYP19A基因cDNA序列的克隆
• 2.2 CYP19A基因cDNA序列分析
• 2.3 许氏平鮋CYP19B基因cDNA片段的克隆
• 2.4 CYP19B基因cDNA片段序列分析
• 2.5 许氏平鮋CYP19基因的进化分析
• 2.6 CYP19基因在许氏平鮋中的组织表达
• 2.7 CYP19基因在雌性许氏平鮋卵巢不同发育阶段的表达
• 2.8 CYP19基因在雄性许氏平鮋精巢不同发育阶段的表达
• 2.9 CYP19基因在不同发育阶段的雌性许氏平鮋脑组织中表达
• 2.10 CYP19基因在不同发育阶段的雄性许氏平鮋脑组织中表达
• 3 讨论
• 3.1 许氏平鮋芳香化酶基因克隆
• 3.2 许氏平鮋芳香化酶基因结构分析
• 3.3 许氏平鮋CYP19基因组织表达特点
• 3.4 许氏平鮋CYP19基因在不同发育阶段性腺的表达特点
• 3.5 CYP19基因在不同发育阶段许氏平鮋脑组织中的表达特点
• 4 小结
• 参考文献
• 致谢