论文摘要
FKN／CX3CR1在白细胞迁移、炎症反应、免疫细胞分化、移植排斥反应等过程中发挥极其重要的作用。近十年来，通过生物化学的方法对FKN／CX3CR1的结构和功能的研究取得一些进展，然而决定FKN／CX3CR1功能的结构基础迄今没有系统的研究，本研究通过比较基因组学的方法，系统分析了FKN／CX3CR1可能存在的负选择位点、达尔文正选择位点和缺失／插入位点对FKN／CX3CR1介导的免疫学功能的影响，首次比较全面的阐述FKN／CX3CR1结构与功能的关系，为研究趋化因子及其受体结构与功能的关系提供了新的策略。1．FKN／CX3CR1在高级灵长类物种中的比较基因组学研究观察旧大陆猴（Old World Monkey）包括猕猴（Macaque）和叶猴（LeafMonkey）；人猿超科（Homonid）包括智人（Human）、黑猩猩（Chimpanzee）、大猩猩（Gorilla）、红毛猩猩（Orangutan）和长臂猿（Gibbon）7个高级灵长类物种的FKN／CX3CR1的基因进化规律，用简并引物PCR法分别扩增FKN的3个外显子和CX3CR1后测序并拼接序列，应用MegAlign分析FKN／CX3CR1基因可能存在的缺失／插入位点：应用Datamonkey软件分析FKN／CX3CR1的负选择位点；用Mega中的ME法重构FKN／CX3CR1基因进化树，用PAML中的codeml程序估算每一枝上氨基酸的P距离并对其替换速率和选择压力变化做最大似然法分析，用SPSS进行Pearson相关系数检验。MegAlign分析显示人猿超科较旧大陆猴FKN基因有一明显的10个氨基酸大片段缺失突变。Datamonkey分析结果显示FKN存在负选择位点30Q、61D、216N，CX3CR1存在负选择位点4F、259Y；ME法构建的FKN／CX3CR1基因进化树显示其和物种树均保持一致，Pearson相关系数检验显示FKN／CX3CR1 r值为0.64，而对照组r值为0.07，（p＜0.001）；PAML替换速率分析表明在人和黑猩猩上FKN存在达尔文正选择位点A33、I41、D53、K55、K60、R68和E86，CX3CR1存在达尔文正选择位点K95、D270。结果提示从旧大陆猴向人猿超科进化过程中，FKN／CX3CR1可能由于负选择位点、达尔文正选择压力以及基因的缺失突变而保持协同进化。2．FKN／CX3CR1分子及突变子的基因克隆和表达克隆旧大陆猴和人猿超科7个物种FKN、CX3CR1全基因及其突变体并进行体外表达，为后续观察FKN／CX3CR1在高级灵长类物种进化过程中免疫学功能的演变并在功能上验证FKN／CX3CR1协同进化以及研究上述位点对FKN／CX3CR1介导的免疫学功能的影响奠定分子生物学基础。我们通过SOE-PCR的方法扩增得到7个高级灵长类物种FKN和CX3CR1的全长编码基因，构建pcDNA.3.1／myc-His（-）A-FKN和pcDNA.3.1／myc-His（-）A-CX3CR1质粒，然后在此基础上应用定点突变技术（Site-directed Gene Mutagenesis）得到FKN和CX3CR1各自的突变子，脂质体法将质粒转染CHO细胞并用G418筛选稳定转染细胞株FKN-CHO和CX3CR1-CHO。RT-PCR和Western blot结果表明FKN和CX3CR1均可在CHO细胞中表达。趋化功能实验表明，FKN-CHO细胞上清对CX3CR1-CHO具有显著趋化活性，这些结果提示FKN-CHO细胞能分泌具有活性的FKN蛋白，CX3CR1可在CHO细胞膜上表达并具有生物学功能。3．FKN／CX3CR1在高级灵长类物种中的功能比较研究为了研究FKN／CX3CR1在高级灵长类物种中功能学演变过程，我们体外实验观察比较了7个物种FKN／CX3CR1在亲合力、趋化功能和粘附功能上的进化规律。结果发现从旧大陆猴向人猿超科进化过程中，功能上总体趋势是增强的，并不是依次递增。猕猴和叶猴在相同水平，红毛猩猩和大猩猩在相同水平，黑猩猩和人在相同水平，而在长臂猿这个物种出现功能上的下降。而不同物种间FKN／CX3CR1的作用，均导致亲合力、趋化功能和粘附功能降低。表明FKN／CX3CR1在高级灵长类物种中是协同进化的。4．FKN／CX3CR1负选择位点、可能存在的达尔文正选择位点及缺失片段的体外功能研究观察负选择位点，可能存在的达尔文正选择位点及缺失片段对FKN／CX3CR1介导的功能的影响，应用定点突变技术构建不同的突变子，体外实验观察突变子对FKN／CX3CR1在亲合力、趋化功能和粘附功能上的影响。点突变FKN负选择位点30Q和61D都导致亲合力、趋化功能的明显下降，但粘附功能无改变；而点突变FKN负选择位点216N，明显降低粘附功能，但对亲合力和趋化功能无影响。而点突变CX3CR1负选择位点4F、259Y导致亲合力、趋化功能和粘附功能都下降。另外，点突变FKN的达尔文正选择位点A33、141、D53、K55、K60、R68和E86后结果显示：D53、K55、K60、R68突变导致亲合力、趋化功能降低，而粘附功能无改变；而E86的突变明显降低粘附功能，但对亲合力、趋化功能无影响。而A33、141的突变对亲合力、趋化功能和粘附功能都无影响；点突变CX3CR1的达尔文正选择位点K95、D270，导致亲合力、趋化功能和粘附功能都降低；同时发现人猿超科FKN中缺失的10个氨基酸位点对亲合力、趋化功能无影响，但明显降低粘附功能。综上所述，从旧大陆猴向人猿超科进化过程中，FKN／CX3CR1基因是协同进化的，高级灵长类物种中FKN／CX3CR1存在的负选择位点、人和黑猩猩中FKN／CX3CR1存在的达尔文正选择位点以及人猿超科FKN缺失的10个氨基酸位点对FKN／CX3CR1介导的趋化和粘附功能有不同的重要作用。
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相关论文文献
- [1].FKN/CX3CR1信号途径抗凋亡作用的研究进展[J]. 医学研究与教育 2018(03)
标签：人猿超科论文; 旧大陆猴论文; 基因协同进化论文; 负选择位点论文; 达尔文正选择位点论文; 缺失突变论文; 结构与功能论文;