一个新的稻瘟菌致病相关基因MgLDB1的鉴定与功能分析

论文摘要

稻瘟病（rice blast）是水稻上重要的病害之一,其病原菌为Magnaporthe grisea.了解M.grisea的致病分子机理不仅有利于稻瘟病的防治,而且作为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式系统,对于了解其它真菌的致病机理也有重要意义.T-DNA插入突变是鉴定致病相关基因的有效途径.本文通过农杆菌介导的稻瘟病菌转化发现一个致病相关基因MgLDB1,并用基因敲除和基因互补策略研究了MgLDB1基因在调控着稻瘟菌生长、分生孢子形成、有性生殖、致病性和细胞完整性等方面的重要作用.具体研究结果如下:1致病性缺陷突变体A2-12-3获得经4次农杆菌介导的稻瘟菌转化获得3600个T-DNA插入转化子.经致病性测定鉴定出四个致病性丧失转化子A1-3-9、A1-17-9、GPD1-1和A2-12-3,其中A2-12-3转化子在CM和燕麦等培养基上没有分生孢子形成。2 A2-12-3突变体及T-DNA标记基因鉴定经巢式反向PCR及其PCR产物克隆测序,外源T-DNA插入到稻瘟病菌假定蛋白基因MG01057.5的第四个外显子内,该基因有7个外显子,6个内含子,编码809个氨基酸.该基因编码的氨基酸序列与其它同源序列的相似性很低,且同源区集中在MgLDB1基因第400—第750氨基酸之间;结构预测表明这段氨基酸序列是LIM-domain bind结构域,在这个同源区有多个保守氨基酸,它们可能是LIM-domain binding蛋白的结构和功能基础.另外,在MgLDB1基因所编码的氨基酸序列中有KRRRPS...PRMQKR氨基酸区域,这个氨基酸序列与动物线虫、果蝇、小鼠和人类LDB基因的核定位序列从构成上具有很大的一致性,可能这些氨基酸是MgLDB1基因的核定位序列.3 MgLDB1突变体表型分析一系列生物学性状研究表明,MgLDB1基因插入突变体A2-12-3和缺失突变体Amgldb1（AK58）生物学性状具有很大的一致性,它们与野生型Guy11性状有很大的差异:（1）突变体菌落形态呈暗绿色,常有水浸状斑出现,气生菌丝少,生长缓慢;（2）在不同的固体培养基上,没有分生孢子产生,也不能够完成有性生殖;（3）离体接种后,突变体对有、无伤口大麦都完全丧失致病性,对无伤口水稻也丧失了致病性,但是对有伤口水稻表现出轻微的致病性;（4）细胞完整性增强不同浓度SDS、calcofluor white、cango red和glucanex处理后,野生型Guy11在0.02%SDS浓度下不能够存活,而突变体A2-12-3和AK58在0.04%SDS依然可以生存;随着calcofluor white浓度增加,对突变体A2-12-3和AK58生长抑制较小,对野生型抑制作用较大;cango red对野生型和突变体菌落生长速度影响较小,且cango red对突变体和野生型抑制作用差异不明显;细胞壁降解酶Glucanex处理后突变体原生质体产量较低,说明基因突变体细胞完整性增强,对外界逆境具有更大的抗性;（6）不同浓度的NaC1处理后,突变体对渗透压敏感性变化不大.以上研究结果表明,MgLDB1调控着多个生物学性状.4 MgLDB1时空表达以MgLDB1-GFP融合表达的恢复型转化子AC26为材料,经菌丝和分生孢子GFP与核染料DAPI荧光定位表明:MgLDB1蛋白定位于细胞核,这与LDB基因是核定位基因相符合.在该基因时序表达研究中,主要分析了菌丝、分生孢子及其分生孢子萌发形成附着孢过程中不同时间该基因的表达情况,结果表明该基因在稻瘟菌整个生命发育过程中不同发育阶段都有表达,调控着细胞发生、发展和分化,与LDB基因在整个生物发育过程中都参与调控相吻合.5 MgLDB1突变体的表型互补pCB1532-MgLDB1-GFP融合表达载体（即MgLDB1基因互补载体）转化到MgLDB1基因缺失突变体A2-12-3原生质体后,获得10个有荧光表达的恢复转化子。恢复转化子的菌落形态、生长速度、分生孢子、产孢量、有性生殖、致病性等生物学性状与野生型Guy11性状有很大的一致性.MgLDB1基因引进A2-12-3突变体中恢复了野生表型性状,进一步证明该基因对这些性状的调控功能.经过上述研究证明MgLDB1基因在调控着稻瘟菌生长、分生孢子形成、有性生殖、致病性和细胞完整性等方面具有重要的作用.

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 LIM域结合蛋白（LDB）研究进展
• 1.1.1 LIM结合蛋白（LDB）的发现
• 1.1.2 LIM结合蛋白（LDB）的分类
• 1.1.3 LDB基因不同剪接方式及其蛋白结构特点
• 1.1.3.1 LDB基因不同剪接
• 1.1.3.2 LDB蛋白结构特点
• 1.1.4 LIM域结合蛋白LDB的功能
• 1.1.5 LIM域结合蛋白的剂量对生物学功能的影响
• 1.1.6 LDB互作蛋白—LIM结构域蛋白的研究
• 1.1.6.1 LIM结构域蛋白发现与结构
• 1.1.6.2 LIM结构域蛋白分类
• 1.1.6.3 LIM结构域蛋白功能
• 1.1.6.3.1 LIM-HD功能
• 1.1.6.3.2 核定位单纯LIM蛋白（LMO）
• 1.1.6.3.3 穿梭于细胞质和细胞核的LIM结构域蛋白
• 1.1.7 LDB蛋白的降解
• 1.1.8 LDB蛋白与LIM蛋白互作的分子机制
• 1.2 稻瘟病与稻瘟病菌
• 1.2.1 稻瘟病菌的生活史
• 1.2.2 稻瘟病菌附着胞形成
• 1.2.3 参与稻瘟病菌附着胞形成的相关基因
• 1.2.3.1 分生孢子形成相关基因
• 1.2.3.2 参与表面识别相关基因基因
• 1.2.3.3 跨膜蛋白相关基因
• 1.2.3.4 甘油合成相关基因
• 1.2.3.5 黑色素合成相关基因
• 1.3 MAPKinase及其它稻瘟菌信号转导途径
• 1.3.1 MAPKinase信号转导途径
• 1.3.1.1 MAPKinase在哺乳动物上的研究
• 1.3.1.2 MAPKinase在植物上的研究
• 1.3.1.3 MAPKinase在真菌上的研究
• 1.3.1.4 MAPKinase在稻瘟菌上的研究
• 1.3.2 其它稻瘟菌信号转导途径的研究
• 1.3.2.1 cAMP途径
• 1.3.2.2 G蛋白途径
• 2+离子途径'>1.3.2.3 Ca²⁺离子途径
• 1.4 研究方案及技术路线
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 稻瘟病菌致病相关基因MgLDB1鉴定与功能分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验菌株
• 2.1.2 实验所用培养基
• 2.1.2.1 细菌培养基:
• 2.1.2.2 AIM培养基
• 2.1.2.3 CM培养基及其它培养基
• 2.1.2.4 BDCM培养基
• 2.1.2.5 大麦粒培养基
• 2.1.2.6 燕麦片培养基
• 2.1.2.7 MM培养基
• 2.1.3 分子生物学实验
• 2.1.3.1 PCR反应
• 2.1.3.2 DNA酶切
• 2.1.3.3 酶切片段的去磷酸化（SAP）
• 2.1.3.4 DNA片段的凝胶回收
• 2.1.3.5 连接反应
• 2.1.3.6 CTAB法提取基因组DNA
• 2.1.3.7 Southern杂交分析（DIG）
• 2.1.3.7.1 DIG-DNA标记
• 2.1.3.7.2 稻瘟病菌基因组DNA的消化、电泳及变性
• 2.1.3.7.3 DNA转膜
• 2.1.3.7.4 Southern杂交过程
• 2.1.3.7.5 免疫显色
• 2.1.4 感受态的制备与转化
• 2.1.4.1 E.coliDH5α感受态制备与转化
• 2法）'>2.1.4.1.1 热激感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.1.4.1.2 大肠杆菌转化
• 2.1.4.2 农杆菌感受态的制备与转化
• 2.1.4.2.1 农杆菌电激感受态制备
• 2.1.4.2.2 农杆菌电激转化
• 2.1.4.3 农杆菌介导的稻瘟菌转化
• 2.1.5 稻瘟菌原生质体的制备与转化
• 2.1.5.1 稻瘟菌原生质体制备
• 2.1.5.2 稻瘟菌原生质体转化
• 2.1.6 稻瘟病菌性状研究
• 2.1.6.1 菌落生长速度及菌落特性
• 2.1.6.2 稻瘟病菌产孢培养和产孢量
• 2.1.6.3 附着孢形成实验
• 2.1.6.4 稻瘟菌有性生殖实验
• 2.1.6.5 稻瘟菌单孢分离实验
• 2.1.6.6 大麦和水稻离体接种
• 2.1.6.7 洋葱表皮穿透实验
• 2.1.6.8 细胞壁降解酶对细胞完整性的影响
• 2.1.6.9 NaC1对菌落生长的影响
• 2.1.6.10 SDS对细胞完整性的影响
• 2.1.6.11 刚果红对细胞完整性的影响
• 2.1.6.12 Calcoflour white对细胞完整性的影响
• 2.1.6.13 稻瘟病菌细胞核的DAPI染色与观察
• 2.1.6.13.1 稻瘟菌分生孢子细胞核的DAPI染色与观察
• 2.1.6.13.2 稻瘟菌菌丝体细胞核的DAPI染色与观察
• 2.1.6.14 稻瘟病菌菌丝、分生孢子和附着孢的GFP观察
• 2.2 试验结果与分析
• 2.2.1 A2-12-3突变体的获得
• 2.2.1.1 稻瘟菌的转化
• 2.2.1.2 转化子致病性的初步筛选及突变体A2-12-3的获得
• 2.2.1.3 致病缺陷突变体A2-12-3遗传稳定性测定
• 2.2.2 突变体A2-12-3突变基因鉴定及序列分析
• 2.2.2.1 巢式反向PCR方法改进及引物设计
• 2.2.2.2 突变体A2-12-3的T-DNA侧翼DNA序列获得
• 2.2.2.3 突变体A2-12-3T-DNA标记基因的鉴定与分析
• 2.2.2.3.1 A2-12-3突变体T-DNA插入基因的鉴定
• 01057.5分析'>2.2.2.3.2 突变体A2-12-3突变基因MGG₀1057.5分析
• 2.2.3 MgLDB1基因的时空表达
• 2.2.3.1 MgLDB1-GFP融合表达
• 2.2.3.2 LDB1基因的表达定位
• 2.2.3.3 MgLDB1基因在附着孢形成过程中的表达
• 2.2.4 MgLDB1基因缺失突变
• 2.2.4.1 MgLDB1基因缺失载体的构建
• 2.2.4.2 敲除突变体的获得及其验证
• 2.2.5 MgLDB1基因突变体的恢复突变
• 2.2.5.1 互补载体构建
• 2.2.5.2 互补转化子的获得
• 2.2.6 生物学性状研究
• 2.2.6.1 △AMgLDB1（AK58）突变体菌落形态和生长速度
• 2.2.6.2 △MgLDB1（AK58）突变体不能形成分生孢子
• 2.2.6.3 缺失突变体△MgLDB1（AK58）有性生殖丧失
• 2.2.6.4 △MgLDB1突变体致病性研究
• 2.2.6.4.1 △MgLDB1突变体对大麦致病性测定
• 2.2.6.4.2 AMgLDB1突变体对水稻致病性测定
• 2.2.6.5 MgLDB1基因突变对细胞完整性影响
• 2.2.6.5.1 MgLDB1基因细胞完整性影响（一）—SDS处理
• 2.2.6.5.2 基因突变对细胞完整性影响（二）—刚果红处理
• 2.2.6.5.3 基因突变对细胞完整性影响（三）——calcofluor white处理
• 2.2.6.5.4 基因突变对细胞完整性影响（四）——Glucanex处理
• 2.2.7 MgLDB1基因突变后对渗透压敏感性影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 扩增T-DNA侧翼基因组DNA序列（鉴定标记基因）方法的改进
• 2.3.2 MgLDB1基因的信息生物学分析
• 2.3.3 LDB基因功能研究
• 2.3.4 MgLDB1基因生殖作用的影响
• 2.3.5 MgLDB1基因是细胞完整性负调控因子
• 2.3.6 研究MgLDB1突变体细胞对渗透压敏感性变化
• 2.3.7 未来研究
• 第三章 突变体A1-17-9的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 基因克隆及其序列分析
• 3.2.1.1 反向巢式PCR扩增A1-17-9突变体T-DNA的左侧翼序列
• 3.2.1.2 A1-17-9突变体T-DNA插入基因鉴定
• 3.2.1.3 A1-17-9突变体T-DNA标记基因信息生物学分析
• 3.2.2 A1-17-9突变体生物学特性研究
• 3.2.2.1 A1-17-9突变体的菌落形态和生长速度
• 3.2.2.3 A1-17-9突变体的大麦和水稻致病性测定
• 3.2.2.4 A1-17-9突变体的附着孢形成实验
• 3.2.2.5 A1-17-9突变体的洋葱表皮穿透实验
• 3.2.2.6 有性生殖实验
• 3.2.2.7 突变体A1-17-9单孢分离、潮霉素抗性与致病性实验
• 3.2.2.7.1 A1-17-9突变体子囊孢子的单孢分离
• 3.2.2.7.2 单孢分离后潮霉素抗性实验
• 3.2.2.7.3 单孢菌落的致病性实验
• 3.3 本章小结
• 参考文献