论文摘要
肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一。目前其发病率和死亡率都逐年升高。晚期肾癌治疗手段有限、疗效欠佳,主要的原因是其对放化疗、免疫内分泌治疗等辅助治疗均不十分敏感,靶向治疗也仅在少数患者有部分作用。目前中晚期肾癌占大多数,且术后常发生肾癌的复发和转移,因此研究肾癌发生、发展的机制,同时寻求有效地抑制肾癌、改善其化疗耐药的现状有十分重要的意义。microRNA （miR）是近些年来的研究热点,它是一种非编码的小分子单链RNA。不具备开放阅读框架,并不真正有效地表达蛋白,但它可以有效地调节目的基因表达。其主要的方法是通过其种子区与特异性靶向基因的mRNA的3’UTR相结合,诱导靶基因mRNA水平下调或使其翻译抑制,进而调控目的基因表达。目前越来越多的研究表明miR表达的异常是许多肿瘤共同的特征,它在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。miR-381和miR-424也不例外,尽管目前对miR-381和miR-424研究相比较少,但它们对多种肿瘤的影响很明确。miR在肾癌中的功能研究取得了一些进展,但肾癌中miR表达、功能及调节是相当复杂的,目前miR-381和miR-424在肾癌中研究尚未见报道。我们首次发现WEE1是miR-381和miR-424的共同靶基因。WEE1蛋白激酶是WEE家族成员之一,它高度保守并广泛存在于真核生物中。它是一种丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶。它是调节细胞周期G2/M期的关键因子,在确保细胞进入有丝分裂前完成DNA复制以及在DNA损伤修复中起着关键作用。目前恶性肿瘤中WEE1的异常表达已有初步报道和研究,而文献中并未见其在肾癌中的研究。已有研究表明外源性的WEEl抑制剂可以通过调节细胞周期G2/M使外源性的DNA损伤（可因5-FU化疗引起）得不到及时修复而导致细胞凋亡和“有丝分裂灾难”。因此,我们推测,miR-381作为内源性的WEE1抑制剂可能可以增加肾癌细胞对5-FU的化疗敏感性。在本研究中,我们首次对miR-381和1miR-424及其靶基因在肾癌细胞株中表达特征进行了探讨；分析和验证了miR-381、miR-424和WEE1的直接靶向关系；我们还首次针对miR-381和miR-424在肾癌细胞中细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期和caspase3/7活性的作用进行了分析；另外,我们还研究了miR-381对5-FU的IC50的影响；最后我们研究和证实了miR-381和miR-424影响肾癌细胞株生物学行为的机制。本研究的创新点在于1)国内外首次发现miR-381和miR-424可应用于抑制肾癌细胞株增殖、促进其凋亡,并进一步阐述了其机制；2)我们还首次发现miR-381和miR-424在肾癌细胞株中呈协同效应,而这种协同效应在所有miR的研究中是非常少见的；3)我们还首次发现miR-381增强5-FU对肾癌细胞株的抑制作用,这可能为肾癌的治疗提供一种全新的方式；4)我们首次证实了miR-381和miR-424与WEEl的直接靶向关系。图57幅,表19个,参考文献86篇。第一章miR-381和miR-424在肾癌中表达特点及其靶基因分析目的：分析并验证miR-381和miR-424的靶基因,研究miR-381、 miR-424和WEE1在肾癌细胞和肾小管上皮细胞中的表达特征。方法：利用生物信息学预测miR-381和miR-424的靶基因,利用双荧光素酶实验来验证miR-381和miR-424的直接靶向基因。用RT-PCR、 Western blot等方法对miR-381和miR-424及其靶基因的表达特性进行研究。结果：WEE1是miR-381和miR-424的共同靶基因,WEE1基因3’-UTR与miR-381和miR-424的结合区域呈高度保守。miR-381、 miR-424和靶基因WEE1结合稳定性强。双荧光素酶实验证明miR-381和miR-424可直接靶向WEE1。过表达miR-381和miR-424都可以引起靶基因WEE1表达下调。miR-381和miR-424在肾癌细胞株中呈低表达,而WEE1呈高表达。结论：miR-381和]miR-424及其靶基因在肾癌细胞株中表达异常,二者具有共同的靶基因WEE1。 miR-381和miR-424可以直接靶向调节WEEl基因表达。为我们进一步深入研究miR-381和miR-424在肾癌中发生、发展的机制打下一定基础。第二章miR-381和miR-424对肾癌细胞生物学功能影响及其机制研究目的：过表达miR-381和miR-424后分析其功能及其对肾癌细胞株生物学行为的影响,并进一步分析其可能的机制。方法：在肾癌细胞株786-O、ACHN和肾小管上皮细胞株HK-2中,采用瞬时转染的方法过表达miR-381和miR-424,再通过分析细胞周期、细胞凋亡、细胞生存率和caspase3/7活性等指标研究miR-381和1miR-424在肾癌细胞株中的功能,最后通过Western Blot检测其靶基因WEE1、相关细胞周期蛋白激酶、凋亡蛋白和WEE1作用底物Cdc2的表达分析miR-381和miR-424的作用机制。结果：联合转染miR-381和miR-424可以抑制肾癌细胞株786-O增殖和促进其凋亡,可以增加caspase3/7活性,同时还可以使细胞周期G2/M比例下调。对另一肾癌细胞株ACHN无类似作用。单独使用miR-381或miR-424作用并不显著,miR-381和miR-424呈协同作用。miR-381和miR-424可以抑制WEE1蛋白激酶进而调节Cdc2,最终引起细胞DNA损伤无法及时修复而凋亡。结论：联合过表达miR-381和miR-424有抑制肾癌细胞株786-O的功能,二者呈协同作用。联合过表达miR-381和]miR-424过表达不能抑制肾癌细胞株ACHN功能,可能和P53活性相关。miR-381和miR-424可以不依赖于MYT1和Cdc25途径直接调控Cdc2进而导致细胞凋亡增加和“有丝分裂灾难”。图幅,表个,参考文献篇第三章miR-381增强5-FU在肾癌细胞株中化疗敏感性及其机制目的：研究miR-381在经5-FU诱导外源性DNA损伤的肾癌细胞株中的作用,并进一步分析其机制。探索miR-381和5-FU在肾癌细胞株中协同作用。方法：使用不同浓度的5-FU作用于786-O、ACHN和HK-2中,再采用瞬时转染的方法过表达miR-381,在不同的时间点检测细胞的生存率,并分析细胞周期、细胞凋亡和caspase活性等指标。检测5-FU处理并同时过表达miR-381的上述细胞株中WEEl及相关下游基因、凋亡蛋白的表达,分析其机制。利用siRNA和MTT实验进行了回复实验。结果：在786-0中,在不同的5-FU浓度下,转染miR-381组与对照组相比,其对细胞抑制作用增加,其最佳作用时间为48小时。过表达miR-381明显下调5-FU的IC50,联合使用miR-381和5-FU可显著增加caspase3/7活性、增加细胞凋亡并影响细胞周期。在ACHN中无类似作用可能和P53活性有关。联合使用miR-381和5-FU可下调WEE1的表达并抑制了“分子开关”Cdc2磷酸化。回复实验表明,在我们转染miR-381于5-FU作用过的肾癌细胞株786-0后,外源性转染WEE1可部分“撤消’’miR-381及5-FU对786-0的细胞增殖的抑制作用。结论：在肾癌细胞株中,过表达miR-381联合使用5-FU可有效地抑制肾癌细胞株786-0并增加化疗敏感性,使5-FU的IC50明显下调,使治疗剂量的5-FU即可发挥更强的抗肿瘤作用。其机制一是5-FU诱导细胞DNA损伤未经G2检查点修复即进入有丝分裂进而引发“有丝分裂灾难”；二是通过Bcl-2且不依赖于PARP的凋亡途径。