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mTOR/S6K1信号通路在高脂饮食诱导C57BL/6小鼠胰岛素抵抗发生中的作用及有氧运动对其影响的研究

2020-12-06阅读(579)

mTOR/S6K1信号通路在高脂饮食诱导C57BL/6小鼠胰岛素抵抗发生中的作用及有氧运动对其影响的研究

论文摘要

目的:通过高脂饮食诱导C57BL/6小鼠产生胰岛素抵抗,观察正常饮食小鼠和胰岛素抵抗小鼠在安静和/或有氧耐力运动后骨骼肌细胞中mTOR（Mammalian Target of Rapamycin）及其下游效应因子S6K1（p70 Ribosomal S6 Kinase 1）和PGC-1α（Peroxisome Proliferator-Activated Receptor- Coactivator 1α）的mRNA和蛋白表达变化,探讨mTOR/S6K1在胰岛素抵抗发生中的作用,以及有氧耐力运动对胰岛素抵抗小鼠骨骼肌mTOR/S6K1和PGC-1α的影响,并探究其分子生物学机制。方法:（1）胰岛素抵抗动物模型的建立:8周龄C57BL /6小鼠随机分为正常饮食组和高脂饮食组,每组各20只,高脂饮食组喂养8周后建立胰岛素抵抗模型。随后将正常饮食组再次随机分为正常饮食安静组（NC）和正常饮食运动组（NE）;高脂饮食组也随机分为高脂饮食安静组（HC）和高脂饮食运动组（HE）。（2）运动方案:各运动组进行为期6周、75%VO2max强度跑台训练,1次/天,60min/次,5次/周。（3）检测空腹血清胰岛素值:取材前禁食12小时,乙醚麻醉后内眦取血,离心提取血清,用ELISA法检测血清中胰岛素水平。（4）口服葡萄糖耐量（OGTT）:小鼠禁食14-16小时,分别称量小鼠体重并做好记录,鼠尾静脉取微量血,使用小型血糖仪检测空腹血糖值,并将此时间点血糖值设定为T0。随后迅速给小鼠根据体重经口腔灌注10μl/g, 20%葡萄糖溶液,分别检测T15, T30, T60, T90, T150和T180min各时间点血糖值。（5）观察胰岛β细胞团面积:取胰腺组织10%甲醛固定,石蜡包埋,切片、HE染色,在显微镜下观察胰岛形态学变化。（6）采用Northern blot检测骨骼肌中mTOR、S6K1和PGC-1αmRNA的表达（。7）采用Western blot检测骨骼肌中mTOR、S6K1、pS6K1-Thr389和PGC-1α蛋白的表达。（8）采用免疫荧光法检测骨骼肌中mTOR、S6K1、pS6K1-Thr389的表达和定位:取骨骼肌组织,4%多聚甲醛固定,30%蔗糖脱水,OCT包埋,冰冻切片,免疫组织化学染色,共聚焦免疫荧光显微镜检测mTOR、S6K1、P-S6K1-Thr389蛋白的表达和定位。结果:（1）小鼠体重变化:HC组小鼠体重比NC组高21.99%（P<0.05）;HE组小鼠体重比HC组低22.75%（P<0.01）。（2）空腹胰岛素值:饮食和运动效应及饮食和运动的交互效应对小鼠空腹胰岛素值均有显著性影响。HC组空腹胰岛素值比NC组高181.81%（P<0.01）;HE组比HC组空腹胰岛素值低41.9%（P<0.05）。（3）OGTT:高脂饮食后HC组与NC组相比,OGTT峰值明显升高,且出现的时间点明显后移,血糖值在30min后下降缓慢,在180min后仍明显高于基础值;有氧运动后HE组与HC组相比,OGTT峰值明显下降,出现的时间点前移,随后血糖值能迅速下降,但在180分钟时血糖值仍高于基础值。（4）胰岛形态学改变: HC组小鼠胰岛β细胞团面积%明显比NC组大85.71%（P<0.001）,而HE组小鼠胰岛β细胞团面积%比HC组小30.77%（P<0.05）。从H&E染色后的胰岛β细胞团组织形态学观察发现HC组胰岛细胞团明显增大的同时,还可以观察到炎性浸润的表现,而HE组胰岛炎性症状明显轻于HC组。（5）骨骼肌中mTOR mRNA和蛋白的表达:HC组骨骼肌mTOR mRNA（125.61±10.43 vs 100.00, P<0.05 ）和蛋白（137.41±7.86 vs 100.00,P<0.01）的表达明显高于NC组,而HE组骨骼肌mTOR mRNA（105.17±4.10 vs 125.61±10.43, P<0.05）和蛋白（111.00±7.33 vs 137.41±7.86, P<0.05）的表达明显低于HC组。经免疫荧光检测mTOR蛋白表达趋势与Western blot结果一致,且mTOR蛋白主要在胞浆中表达。（6）骨骼肌中S6K1 mRNA和蛋白及磷酸化S6K1-Thr389蛋白的表达:HC组S6K1 mRNA（154.98±16.26 vs 100.00, P<0.01）和蛋白（ 137.36±3.08 vs 100.00,P<0.01 ）及pS6K1-Thr389蛋白（ 390.15±69.62 vs 50.59±16.65,P<0.001）的表达明显高于NC组,而HE组S6K1 mRNA（120.85±2.42 vs 154.98±16.26, P<0.05）和蛋白（102.51±19.77 vs 137.36±3.0, P<0.05）及pS6K1-Thr389蛋白（179.55±35.70 vs 390.15±69.62, P<0.05）的表达明显低于HC组。经免疫荧光检测S6K1和磷酸化S6K1-Thr389蛋白表达趋势与Western blot结果一致,且S6K1和磷酸化S6K1-Thr389蛋白主要在胞浆中表达。（7）骨骼肌中PGC-1αmRNA和蛋白的表达:HC组mRNA（27.99±2.45 vs 100.00, P<0.001）和蛋白（52.02±2.13 vs 100.00,P<0.01）的表达明显低于NC组,而HE组PGC-1αmRNA（63.90±7.80 vs 27.99±2..45, P<0.01）和蛋白（91.97±6.24 vs 52.02±2.13, P<0.05）的表达明显高于HC组。结论:1. mTOR/S6K1信号通路与高脂饮食诱导胰岛素抵抗的发生密切相关;2.有氧运动明显抑制了IR小鼠骨骼肌中mTOR和S6K1的表达,而有氧运动可以显著升高IR小鼠骨骼肌中PGC-1α的表达。由此推断,有氧运动可能是通过抑制mTOR/S6K1信号通路的传导,增加机体尤其是骨骼肌组织的能量代谢。3.有氧运动可以显著增加机体组织对胰岛素的敏感性,从而改善胰岛素抵抗。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 1. 前言
  • 2. 实验材料
  • 2.1 实验动物
  • 2.2 实验动物分组
  • 2.3 动物饲料配方
  • 2.4 实验动物 IR 模型以及动物的运动方案
  • 2.5 实验流程
  • 2.6 实验仪器和试剂
  • 3. 实验研究方法
  • 3.1 胰岛素抵抗动物模型的建立
  • 3.2 动物血液、骨骼肌、胰腺样本留取
  • 3.3 血液生化指标测试
  • 3.4 胰岛β细胞形态学观察
  • 3.5 Northern blot 法测定骨骼肌中 mTOR、S6K1 和 PGC-1α mRNA 表达
  • 3.6 Western Blot 测定骨骼肌中 mTOR、S6K1、pS6K1-Thr389 和 PGC-1α 蛋白表 达
  • 3.7 统计学处理
  • 4. 实验结果
  • 4.1 动物体重的变化
  • 4.2 空腹血清胰岛素水平
  • 4.3 口服葡萄糖耐量试验
  • 4.4 胰岛 β 细胞形态学变化
  • 4.5 骨骼肌mTOR mRNA及蛋白表达
  • 4.6 骨骼肌中 S6K1 mRNA 和蛋白表达及 pS6K1-Thr389蛋白表达
  • 4.7 骨骼肌中 PGC-1α mRNA 和蛋白表达
  • 5. 讨论
  • 5.1 IR的发生与骨骼肌细胞mTOR/S6K1信号通路的关系
  • 5.2 有氧耐力运动对骨骼肌细胞mTOR/S6K1表达的影响与胰岛素敏感性
  • 6. 结论
  • 参考文献
  • 综述
  • 参考文献
  • 缩略词索引
  • 致谢
  • 个人简历

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