论文摘要
研究背景瘢痕是各种创伤组织修复愈合的必然结果。它主要发生在创伤、感染、手术和烧伤等创面中。增生性瘢痕（hypertrophic scar,HS）是最常见的病理性瘢痕（Pathologic Scar）,其是以成纤维细胞的过度增生和细胞外基质成分的过度聚集为主要特征,临床上其虽然仅局限在原伤口范围内生长,但其发病机制至今尚不确切。其临床表现为局部疼痛、瘙痒、突出于皮肤表面的增生肿块,并伴有不同程度的功能障碍,危害人们的身心健康,在预防及治疗上尚无特效方法,是目前整形外科研究的热点和难点问题之一。细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象,是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。细胞凋亡（apoptosis）,又称为程序性细胞死亡（programmed cell death,PCD）,是有别于细胞坏死而受基因控制的一种主动性细胞自杀过程。肿瘤坏死因子凋亡配体[Tumor necrosis factor（TNF）-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL]广泛地存在于人体各个组织和器官,能定向地导致异常细胞的凋亡,而不会影响正常细胞的生长分化。在增生性瘢痕中TRAIL的死亡受体5（DeathReceptor 5,DR5）起着重要的促凋亡作用。越来越多的研究表明许多疾病的发生、发展都与TRAIL的凋亡抑制有关,以TRAIL作为靶点治疗或缓解疾病已经成为研究热点,并已应用于临床实验中。核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）是一种具有多向性调节作用的转录因子,对细胞内许多基因的表达起着关键性的调控作用,参与细胞的生长、发育、凋亡等多种生理功能,并在细胞恶性转化、纤维化等方面起重要作用。越来越多的研究表明许多疾病的发生和发展都与NF-κB的过度活化有关。NF-κB信号转导通路也贯穿于创伤修复与愈合的整个生物学过程。研究表明,NF-κB p65是NF-κB信号传导通路的关键基因。目前,有关TRAIL及其DR5和NF-κB p65在难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕中表达状况如何、它们之间的联系如何等问题国内外尚未见报道。本研究拟以人难愈合创面肉芽组织、不同时间范围阶段的增生性瘢痕为研究对象,以正常皮肤为对照,采用免疫组化、RT-PCR和Western blot技术检测TRAIL及其死亡受体DR5和NF-κB在难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕各阶段中的表达,并探讨其之间的联系,以进一步探讨瘢痕增生的机理,为临床治疗增生性瘢痕提供新的研究方向和思路。目的本研究拟观察TRAIL信号传导通路中凋亡因子TRAIL及其凋亡受体DR5和NF-κB信号传导通路关键基因p65在人难愈合创面肉芽组织、不同时间阶段的增生性瘢痕以及正常皮肤标本的表达水平是否存在差异及TRAIL、DR5和NF-κB p65之间的联系。方法收集临床标本40例为实验组,其中难愈性创面难愈合创面肉芽组织（A组）、半年内增生性瘢痕（B组）、半年至一年增生性瘢痕（C组）、一年以上增生性瘢痕（D组）组织各10例,收集正常皮肤组织标本8例为对照组（E组）。采用组织免疫化学方法分析各标本中TRAIL、NF-κB p65表达;提取RNA以及核蛋白,实时荧光定量RT-PCR检测组织中TRAIL、DR5及NF-κB p65mRNA表达水平;利用Western blot技术检测TRAIL以及NF-κB p65的蛋白表达水平。结果1.病理切片HE染色各组组织均为相应的病理表现。A组中可见大量内皮细胞和毛细血管,以及许多新生的圆形纤维母细胞,胶原纤维形成少,有炎性细胞浸润。B组到D组中纤维母细胞逐渐减少,形态由扁圆形逐渐变为细长,炎性细胞和毛细血管逐渐减少至消失,皮下胶原纤维由粗大、紊乱逐渐变细、排列逐渐变规则,表皮较正常皮肤薄,无脚突和皮肤附属器。E组表皮层次清楚,角化层角化明显,皮肤附属器丰富,胶原纤维束排列规则,少而疏松、细胞较少。2.免疫组化SP法染色TRAIL在A组、B组成纤维细胞细胞浆中表达强阳性,C组、D组阳性表达逐渐减弱,接近E组;A组和B组表达明显强于C组、D组和E组;NF-κB p65主要表达部位为基底细胞和成纤维细胞的细胞浆和细胞核内,A组内表达与E组接近,在增生性瘢痕各阶段（B、C、D组）中表达阳性,尤其是在B组中皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显。3.RT-PCR检测TRAILmRNA表达水平在A组和B组呈较高水平,明显均高于其它各组（p＜0.05）,而A组与B组之间差异无显著的统计学意义（p＞0.05）,C组、D组与E组各组间比较,其差异也均无显著的统计学意义（p＞0.05）。DR5mRNA表达水平在A组中最高,明显高于各组（p＜0.05）,B、C、D组表达水平均低于E组,其差异均有显著的统计学意义（p＜0.05）,但B、C、D组之间比较,其差异均无显著的统计学意义（p＞0.05）。NF-κB p65mRNA表达水平各组间比较,其差异均无显著的统计学意义（p＞0.05）。但从各组均数来看,E组和A组处于较低水平（A组为0.38,E组为0.30）,B、C、D组处于较高水平（B组为0.44,C组为0.46,D组为0.47）,数值相近,并且有高于E组和A组的趋势。在TRAIL与DR5线性相关分析中,Pearson相关系数为0.291,P=0.045＜0.05,说明TRAIL与DR5存在正相关。在NF-κB p65与TRAIL线性相关分析中,NF-κB p65与TRAIL的Pearson相关系数为0.371,P=0.009＜0.05,说明NF-κB p65与TRAIL存在正相关。在NF-κB p65与DR5线性相关分析中,Pearson相关系数为-0.088,P=0.554＞0.05,说明NF-κBp65与DR5相关性无显著的统计学意义。4.Western blot检测TRAIL在A组和B组中蛋白表达水平较高,在C组、D组、E组蛋白表达水平基本接近,经统计学处理,A组和B组蛋白表达水平明显高于其它各组（p＜0.05）,而A组与B组之间差异无显著的统计学意义（p＞0.05）。NF-κB p65在A组和E组中蛋白表达水平差异没有显著的统计学意义（p＞0.05）,B组、C组、D组的蛋白表达水平明显要高于A组和E组（p＜0.05）。结论1.在难愈合创面肉芽组织中TRAIL和死亡受体DR5表达水平明显增高,NF-κB p65表达水平较低,表明难愈合创面肉芽组织中细胞凋亡增强,抗凋亡水平受到抑制,组织难以愈合2.在增生性瘢痕早期（半年内）中,TRAIL的表达仍然较高,但其死亡受体DR5的凋亡水平明显低于正常,NF-κB p65的表达明显增强,表明在增生性瘢痕早期瘢痕组织凋亡作用降低,抗凋亡作用明显增强,瘢痕组织表现出明显的增生作用。NF-κB p65皮肤基底细胞层细胞阳性表达尤为明显,表明NF-κB p65可能在增生性瘢痕增生中发挥着重要作用,对增生性瘢痕凋亡有着强有力的抑制作用,促进了增生性瘢痕增生。3.在增生性瘢痕后期（半年-1年）,TRAIL及其死亡受体DR5的表达均处于较低水平,NF-κB p65的表达仍高于正常皮肤,表明在增生性瘢痕后期细胞凋亡水平较低,抗凋亡水平较高,仍有组织增生。4.在增生性瘢痕成熟期（1年后）,TRAIL和NF-κB p65表达水平接近正常皮肤。瘢痕组织凋亡作用增强,增生减弱,变得平坦和消退。5.NF-κB p65与TRAIL存在正相关,表明了TRAIL与NF-κB p65表达水平变化趋势是同向的,在一定程度上反映了TRAIL表达与NF-κB p65表达相互影响和作用。TRAIL与DR5存在正相关,表明TRAIL与其受体DR5表达水平的变化趋势是同向的,在一定程度上反映了组织细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。意义本研究率先检测了TRAIL、死亡受体DR5和NF-κB p65在难愈合创面肉芽组织及增生性瘢痕中不同增生阶段的表达,提示了TRAIL凋亡途径和NF-κBp65凋亡调控极有可能参与难愈合创面肉芽组织和增生性瘢痕的异常凋亡过程,对进一步认识难愈合创面肉芽组织的修复和瘢痕增生的机制及其防治具有一定意义,为我们在临床上开展难愈性肉芽创面治疗和瘢痕增生防治提供新的研究方向和思路。