论文摘要
背景和目的RNAi技术在肿瘤基因治疗方面的研究已较广泛,但是siRNA不具有靶向恶性肿瘤细胞的能力,造成RNAi效应的不确定性。端粒酶在多种恶性肿瘤细胞中高表达,正常细胞中除生殖细胞和造血细胞等外大多无或低表达[1]。人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）是端粒酶活性的主要调控因素,对细胞恶性转化、肿瘤的发生发展意义重大[2]。因此,本研究拟构建端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子siRNA表达体系,研究该表达体系对hTERT表达不同的细胞株的沉默效应,为探讨基因的靶向治疗奠定基础。方法1.建立稳定表达绿色荧光蛋白（EGFP）的肝癌SMMC-7721细胞株和正常人成纤维细胞（HELF）细胞,供检测转染效率用。2 .构建两条靶向EGFP基因的siRNA表达载体siRNA-EGFP-PTZU6+1,双酶切鉴定及测序鉴定插入序列的正确性,转入EGFP-7721细胞中,RT-PCR、Western blot筛选出更好的siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体。3.PCR扩增hTERT启动子的核心片段,将插其入筛选出的siRNA-EGFP-PTZU6+1的U6启动子中,构建靶向EGFP基因的hTERT/U6嵌合启动子（siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1）的siRNA表达载体,正向和反向插入各一个,测序鉴定其正确性。4.将siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1转入EGFP-7721细胞株和EGFP-HELF细胞株中,实时荧光定量PCR和Western blot检测其抑制EGFP基因的表达效果,体外验证其有效性和靶向性。结果1.酶切及测序结果表明成功构建了siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体, RT-PCR、Western blot结果表明两重组质粒siRNA-EGFP-PTZU6+1转染EGFP-7721细胞后,EGFP基因表达无统计学差异,但与对照组相比均显著抑制EGFP基因的表达（P<0.01）。2.测序结果表明成功构建了siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1的表达载体,将其转入EGFP-7721细胞后,RT-PCR结果表明与对照组相比,反向插入的重组质粒显著抑制EGFP基因的表达（P<0.01）。3.实时荧光定量PCR和Western blot结果表明,正向和反向siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染EGFP-HELF细胞与空白质粒比较,EGFP基因表达无差异（P>0.05）。而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后,仅反向siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒抑制EGFP基因表达（P<0.01）。siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒与空白质粒组比较,在EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株中,EGFP基因的表达均具有统计学差异（P<0.01）。结论1.成功构建了siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1的表达载体。2.反向的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1表达载体转染靶细胞后能稳定有效的发挥基因沉默作用。3.反向的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1表达载体对肿瘤细胞具有较高的靶向性。
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相关论文文献
- [1].端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析[J]. 第四军医大学学报 2008(09)
- [2].端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的构建及鉴定[J]. 第三军医大学学报 2008(08)
标签：端粒酶逆转录酶核心启动子论文; 嵌合启动子论文; 表达载体论文; 靶向性论文;