钙调素与ERECTA相互作用的研究 ——拟南芥LFR原核重组蛋白的纯化和多克隆抗体的制备

论文摘要

我室多年的研究工作表明,植物细胞外CaM普遍存在,且具有多种生物学功能,并提出了细胞外CaM可能作为多功能肽类信号,通过质膜上受体介导的信号转导过程,参与多种生物学功能的工作模式。因此对于质膜上细胞外钙调素相互作用蛋白的研究有助于丰富这一假说。本实验借助生物信息学软件,分析寻找拟南芥编码蛋白同时具有分泌信号肽,跨膜域及推测的细胞外CaM结合域的基因,筛选出备选蛋白类受体激酶ERECTA,研究体内外条件下其与CaM的结合特性。首先,借助基因枪瞬时表达系统观察发现ERECTA基因主要定位在细胞膜上,利用钙调素特异性抗体通过免疫组化表明钙调素主要分布于茎顶端等分裂增殖、生长活跃的部位,而已有文献报道ERECTA在该部位也有明显的白表达,这说明胞外钙调素与ERECTA在组织分布上存在共定位的可能。随后,通过酵母双杂交泛素系统和表面等离子共振传感芯片分析表明,拟南芥CaM2可与ERECTA的胞外域相互作用,且结合域与网上软件预测一致。本实验还制备了CaM2与ER双重突变体,胞外钙调素超表达株系与ER突变体杂交纯合体,并鉴定了胞外钙调素超表达株系,用于进行表型观察,为进一步研究胞外钙调素在拟南芥中是否通过与ERECTA基因相互作用来共同调节植物生长发育等功能提供遗传学证据。另外,我室克隆到在拟南芥叶和花发育中具有多效性的新基因lfr-1,为进一步研究该基因编码蛋白的生物学功能及其分子作用机制,将已经构建的融合蛋白重组表达质粒转化到工程菌中诱导表达菌体蛋白,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明融合重组蛋白成功获得了高效表达.重组蛋白经谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白亲和层析法纯化,和SDS-PAGE制备胶割胶富集,电洗脱法纯化后得到纯度较高的抗原.经对新西兰兔进行5次免疫,获得了多克隆抗血清.采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化,结果得到只识别LFR重组蛋白的抗血清.进一步提取野生型拟南芥蛋白和lfr突变体蛋白,经蛋白质印迹检测,结果显示在野生型拟南芥蛋白分子量50kDa左右处出现特异的蛋白质条带而在lfr突变体蛋白中未出现,证明所制备的抗血清可以与拟南芥LFR蛋白特异性结合.

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写表
• 第一部分 植物类受体激酶ERECTA 基因家族的研究进展
• 1 ERECTA 基因家族的发现
• 2 ERECTA 基因家族及其蛋白结构特点
• 3 ERECTA 基因家族的时空表达
• 4 ERECTA 基因家族的生物学作用
• 4.1 ERECTA 基因家族中存在的显性负突变
• 4.2 ERECTA 基因家族通过促进细胞增殖调节拟南芥器官生长和花的发育
• 4.3 ERECTA 基因家族调控气孔的分布和分化
• 4.4 ERECTA 基因家族参与调控胚珠的发育
• 4.5 ERECTA基因家族与MPK3,MPK6共同调节了拟南芥花药早期发育
• 4.6 ERECTA 参与A51/A52 调节的叶近轴与远轴形态建成
• 4.7 ERECTA 与 BREVIPEDICELLUS（BP）共同调节拟南芥节间距和花柄的形态建成
• 4.8 ERECTA 通过与生长素相互作用调节拟南芥花絮的形态建成
• 4.9 ERECTA 在抵御微生物侵染中发挥重要作用
• 5 展望
• 第二部分 钙调素与ERECTA 相互作用的研究
• 前言
• 1 材料与试剂
• 2 实验方法
• 2.1 质粒DNA 的小量提取
• 2.2 基因枪转化洋葱表皮细胞
• 2.3 从工程菌中提取纯化重组钙调素
• 2.4 钙调素抗体制备
• 2.5 免疫印记检测抗体特异性
• 2.6 免疫组织化学定位
• 2.7 ERECTA 基因片段的克隆
• 2.8 质粒酶切
• 2.9 酶切片段的回收
• 2.10 酵母转化
• 2.11 酵母杂交
• 2.12 X-gal 染色
• 2.13 ERECTA 胞外预测结合域诱导表达及纯化
• 2.14 BIAcore 传感芯片标记及SPR 实时结合分析
• 2.15 拟南芥的种植
• 2.16 RNA 的提取
• 2.17 RT-PCR 半定量检测基因转录本的表达
• 2.18 拟南芥杂交及后代筛选鉴定
• 2.19 PCR 鉴定突变体用DNA 小量提取
• 2.20 拟南芥的转化及筛选
• 3 结果与分析
• 3.1 瞬时表达体系中ERECTA 的亚细胞定位
• 3.2 重组ACaM2 的提取纯化及抗血清制备
• 3.3 ACaM2 抗血清特异性检测
• 3.4 免疫组织化学分析
• 3.5 ERECTA 基因片段的克隆和酵母共转化
• 3.6 酵母泛素系统验证ERECTA 与CaM 相互作用
• 3.7 ERECTA胞外CaM预测结合域的表达纯化及其与CaM相互作用的SPR 分析
• 3.8 胞外钙调素超表达株系的筛选鉴定与表型观察
• 3.9 胞外钙调素超表达株系与er 突变体杂交后代纯合体筛选鉴定.
• 3.10 cam2与er 双重突变体的筛选鉴定与表型观察
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三部分 拟南芥LFR 原核重组蛋白纯化和多克隆抗体制备
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组GST:LFR 融合蛋白表达载体的构建与鉴定
• 2.2 重组GST:LFR 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.3 GST:LFR 重组蛋白的分离纯化
• 2.4 抗血清的纯化及特异性检测
• 2.5 抗血清可识别拟南芥内源LFR 蛋白
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 附录
• 1 相关引物序列
• 2 ERECTA-YFP 融合基因表达载体构建（我室王志娟完成）
• 3 ERECTA 胞外CaM 预测结合域表达载体构建（我室王志娟完成）
• 4 重组GST:LFR 融合蛋白表达载体测序
• 5 间接ELISA 检测钙调素抗体效价
• 致谢
• 个人简历