核糖体展示天然鼠源scFv文库筛选己烯雌酚抗体

论文摘要

己烯雌酚（Diethylstilbestrol, DES）是第一个有活性可口服的人工合成非甾体雌激素物质。但是,随着研究的深入,发现DES有对人致癌,致畸以及对生殖系统的危害。针对上述情况,发展检测DES残留的简便、快速、灵敏的方法是有效遏制滥用DES的重要技术手段,也是维护法规制度的必要保障。与其它检测方法相比,具有快速、灵敏、简便特性的检测方法是免疫学分析方法。但是此法需要以特异性的抗体作为检测基础。利用核糖体展示技术筛选单链抗体（singe chain variable fragment, scFv）,成本低,方便进行大规模生产等。从未经免疫的动物或人的免疫组织或B细胞中,构建的天然抗体文库,从理论上讲,只要使用合适的筛选方法,任何抗原都可以从中筛选到相应的抗体,具有较强的通用性。利用核糖体展示技术筛选针对小分子半抗原单链抗体的研究较少,尤其是从天然抗体文库中筛选更是少之又少。目前,还未见到利用此技术从天然抗体文库中筛选DES单链抗体的报道。本研究利用重叠引物延伸法（splicing by overlap extension, SOE） PCR技术构建了天然鼠源单链抗体文库,应用核糖体展示技术筛选己烯雌酚特异的单链抗体。主要研究结果如下：主要研究结果如下：1.从未免疫的6-8周龄Balb/c小鼠的脾脏细胞中提取总RNA,利用Oligo（dT）15引物反转出单链cDNA,再扩增VH、VL基因片段,大小分别约为380 bp,350 bp;合成（G4S）3linker,经序列测定,与理论序列完全一致。利用SOE-PCR构建单链抗体文库,大小约为750 bp,经序列比对,单链抗体的文库中约80%的单链抗体可以正确翻译,无移码突变和致死突变,无终止密码子；测序正确的单链抗体互补决定区氨基酸序列均不相同,证明构建的单链抗体文库具有良好的多样性,可以进行下一步的单链抗体筛选。2.核糖体展示元件T（包含T7启动子,5’茎环,核糖体识别位点）以及间隔序列P（包含3’茎环,间隔序列）是从已构建好的载体pT7PD上扩增,其大小分别为102bp和298bp,两片段分别经序列测定,与理论序列完全一致。以重叠引物延伸法（splicing by overlap extension, SOE）将T片段与scFv文库连接,再将P片段与其拼接,构建成核糖体展示单链抗体文库,大小为1200 bp左右。3.鼠源天然scFv文库质量的鉴定。（1）将构建好的核糖体展示单链抗体文库连接pMD18-T克隆载体后,随机挑取13株送Invitrogen公司测序鉴定文库的完整性和多样性。由测序结果可知,共有9株序列与文库理论大小相符,且能完全正确的翻译,内部无终止密码子,无移码突变和点突变。由序列分析可知文库仍保持着多样性,经Bioedit软件对文库的氨基酸序列分析,CDR区仍然保持着高度的可变性。以上结果进一步验证了利用SOE-PCR构建核糖体展示单链抗体文库的方法是可行的,为下一步文库的筛选打下了坚实的基础。（2）经鉴定,文库的可扩增性,转录活性,反转录活性良好。4.使用固相和液相交替筛选的方法对文库进行七轮筛选,第一轮筛选后RT-PCR得到的条带比较弱,说明原始抗体文库中能与DES结合的抗体较少。经过七轮核糖体展示筛选后,RT-PCR扩增得到的DNA条带亮度明显增加,说明筛选后的抗体文库中抗原阳性的抗体得到了富集。5.将七轮筛选后单链抗体文库进行序列鉴定,其中有43株无致死突变,可以进行DES结合活性的测定。6.随机挑选26个克隆子,将单链抗体基因与pTIG-TRX连接成表达载体,在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定,在约30KDa处有目的蛋白条带,与理论蛋白大小一致,确定表达产物存在于破碎菌体后的上清液中。7.将26株克隆子的表达上清液用间接ELISA和间接竞争ELISA分别鉴定,结果筛选出5株克隆子对DES有特异性的结合。8.对5株克隆子进行序列比对,结果表明CDR区有相似性,推断抗DES单链抗体的抗体识别位点相似。用SPR分析筛出的一株30-3的单链抗体的亲和力为3.79×10-6M。利用Anti-His tag亲和层析柱对表达的单链抗体进行了纯化,使目的条带得到了明显的浓缩。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 典型环境内分泌干扰物:己烯雌酚的概况
• 1.1 己烯雌酚的物理性质
• 1.2 己烯雌酚的应用
• 1.3 己烯雌酚的毒副作用
• 1.4 己烯雌酚残留检测
• 1.4.1 气相色谱法
• 1.4.2 高效液相色谱法
• 1.4.3 薄层色谱法
• 1.4.4 化学发光法
• 1.4.5 放射免疫分析
• 1.4.6 荧光免疫分析
• 1.4.7 酶免疫分析技术
• 2 核糖体展示技术的研究进展
• 2.1 核糖体展示技术的原理
• 2.2 核糖体展示技术的优点
• 2.3 核糖体展示技术已经用于多种大分子的抗体筛选
• 2.4 体外分子进化
• 2.5 利用展示技术从非天然抗体库中筛选小分子污染物的抗体
• 2.6 利用展示技术从天然抗体库中筛选小分子污染物的抗体
• 3 研究目的及意义
• 第二章 单链抗体文库的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 Trizol法提取鼠脾总RNA
• 1.2.2 cDNA的合成
• 1.2.3 鼠源天然单链抗体文库的构建
• 1.2.3.1 VH基因片段的扩增
• 1.2.3.2 VL基因片段的扩增
• 1.2.3.3 linker连接片段的扩增
• 1.2.3.4 linker连接片段的序列正确性鉴定
• 1.2.3.5 scFv文库的构建
• 1.2.3.6 单链抗体文库的多样性鉴定
• 1.2.4 核糖体展示元件的扩增
• 1.2.4.1 T片段的扩增及序列鉴定
• 1.2.4.2 P片段的扩增及序列鉴定
• 1.2.5 单链抗体核糖体展示文库构建
• 1.2.5.1 T片段与单链抗体文库的连接
• 1.2.5.2 P片段与T+S的连接
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠脾脏总RNA的提取
• 2.2 VH,VL以及linker的扩增
• 2.3 Linker序列的鉴定
• 2.4 scFv文库的合成
• 2.5 scFv文库的序列鉴定
• 2.6 T片段和P片段的扩增及序列鉴定
• 2.7 核糖体展示文库的合成
• 3 讨论
• 3.1 小鼠脾脏总RNA的提取
• 3.2 单链抗体文库的构建
• 3.3 核糖体展示元件的扩增及文库的连接
• 第三章 单链抗体核糖体展示文库的质量鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 核糖体展示文库的可扩增性鉴定
• 1.2.2 核糖体展示文库的完整性与多样性鉴定
• 1.2.2.1 制备E.coli DH5α感受态细胞
• 1.2.2.2 核糖体展示文库的序列测定
• 1.2.3 核糖体展示文库的转录活性与反转录活性鉴定
• 1.2.3.1 核糖体展示文库的转录活性鉴定
• 1.2.3.2 核糖体展示文库的反转录活性鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 核糖体展示文库的可扩增性鉴定
• 2.2 核糖体展示文库的序列完整性及多样性鉴定
• 2.3 核糖体展示文库转录活性鉴定
• 2.4 核糖体展示文库反转录活性鉴定
• 3 讨论
• 第四章 利用核糖体展示技术筛选anti-DES单链抗体
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 羧基化的DES与氨基化磁珠的偶联及鉴定
• 1.2.1.1 羧基化的DES与氨基化磁珠的偶联
• 1.2.1.2 偶联后磁珠的鉴定
• 1.2.2 核糖体展示单链抗体文库体外转录与翻译
• 1.2.3 固相亲和筛选
• 1.2.4 液相亲和筛选
• 1.2.5 分离纯化mRNA
• 1.2.6 纯化后mRNA的RT-PCR
• 1.2.7 重新构建下一轮的RD模板
• 1.2.8 筛选后单链抗体文库的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 体外筛选
• 2.2 第四轮,第五轮和第七轮筛选后的RT-PCR产物的序列测定
• 3 讨论
• 3.1 体外表达
• 3.2 亲和筛选及筛选效率的评价
• 3.3 RT-PCR扩增
• 3.4 筛选后序列分析
• 第五章 筛选后单链抗体基因的表达质粒的构建、蛋白表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒与菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 筛选后单链抗体基因的扩增
• 1.2.2 重组scFv原核表达质粒构建
• 1.2.3 制备E.coli BL21（DE3）感受态细胞
• 1.2.4 表达质粒pTIG-TRX-scFv的构建和鉴定
• 1.2.5 筛选后单链抗体蛋白的表达
• 1.2.6 scFv表达蛋白Western Blot的检测
• 2 结果与分析
• 2.1 pTIG-TRX-scFv阳性克隆子验证
• 2.2 pTIG-TRX-scFv的诱导表达
• 2.3 Western Blot鉴定表达的单链抗体
• 3 讨论
• 第六章 单链抗体的性质鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 ELISA法测定单链抗体与抗原结合活性
• 1.2.2 间接竞争ELISA鉴定单链抗体与半抗原DES的特异结合活性
• 1.2.3 筛选有竞争活性的单链抗体序列比对
• 1.2.4 用SPR测定筛选后单链抗体的亲和力
• 1.2.4.1 抗原的固定
• 1.2.4.2 动力学常数的测定
• 1.2.5 可溶性scFv的纯化
• 1.2.5.1 Ni柱再生
• 1.2.5.2 Ni柱纯化
• 2 结果与分析
• 2.1 单链抗体结合活性的检测
• 2.2 筛选后单链抗体的竞争活性的检测
• 2.3 有竞争活性的单链抗体序列比对
• 2.4 SPR分析单链抗体的亲和力
• 2.5 单链抗体的纯化
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢