农杆菌介导灰黄青霉突变体技术的研究

论文摘要

灰黄青霉（Penicillium griseofulvin）是一种重要的产抗生素真菌,从基因水平研究灰黄青霉关键基因的功能,可以加深对其生长、产孢机理的认识,为开发高效、稳定的抗生素提供理论依据。农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的真菌遗传转化（Agrobactirium tumfacience mediated-transformant,ATMT）是当前获得突变子的最优方法之一。因此,本论文进行了农杆菌介导灰黄青霉转化体系研究,初步构建了灰黄青霉T-DNA插入突变体库,并研究了农杆菌介导青霉素（Penicillin）生产菌株产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum）的方法,取得如下结果:（1）质粒和菌株的构建从含有抗博来霉素基因（ble）的质粒pulAc43质粒中克隆ble基因,经双酶切后,与载体pCAMBIA1302质粒连接,构建农杆菌介导青霉转化质粒pCAM-ble;并把pCAM-ble成功转化到农杆菌。（2）农杆菌介导灰黄青霉转化系统的优化通过灰黄青霉转化效率决定影响农杆菌介导丝状真菌转化的多个因素:IM培养基中AS浓度为200μM,农杆菌诱导时间为6h,农杆菌菌液OD600在0.30.5之间,浓缩23倍,与浓度为106个/mL的灰黄青霉孢子悬液等体积混合,400μL混合液涂布到含200μM AS、pH为5.3、铺有微孔滤膜的共培养基上,25℃共培养48h。在该转化条件下EHA105转化灰黄青霉的效率为140230个转化子/106个灰黄青霉孢子。利用上述转化系统得到了200株转化子的灰黄青霉突变体,并且突变子的转化子遗传稳定性高。采用PDA培养基,对突变体中的100株转化子进行了筛选,筛选出一株孢子产生突变子,这株突变子与野生型灰黄青霉相比,在孢子产生数量方面产生变化。（3）农杆菌介导产黄青霉转化体系的探索本研究同时对农杆菌介导青霉素生产菌产黄青霉转化方法进行了探索。应用上述转化灰黄青霉的条件转化产黄青霉也可以得到转化子,但是在该转化条件下EHA105转化产黄青霉的效率比较低,为2080个转化子/106个产黄青霉孢子。并且得到了两株孢子产生突变子,这两株突变子与原始产黄青霉相比,产孢时间显著提前。另外,还得到一株生长速度极低的突变株。然而,对这100株转化子进行了进一步的筛选鉴定时发现,经过几代传代,转化子中ble丢失,说明有些转化子遗传上不稳定。所以,如何建立高转化效率和遗传上稳定的黄青霉转化体系还有必要进一步深入研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 真菌的次级代谢
• 1.1.1 次级代谢及次级代谢产物
• 1.1.2 真菌次级代谢产物
• 1.2 真菌遗传转化方法
• 1.2.1 PEG-CaC12 转化法
• 1.2.2 电激转化法
• 1.2.3 醋酸锂转化法
• 1.2.4 基因枪转化法
• 1.2.5 转座子介导的真菌遗传转化
• 1.2.6 限制性内切酶介导的真菌遗传转化（REMI）
• 1.2.7 农杆菌介导的真菌遗传转化系统（ATMT）
• 1.3 农杆菌介导丝状真菌遗传转化的研究进展
• 1.3.1 根癌农杆菌介导丝状真菌转化的机制
• 1.3.2 农杆菌介导真菌遗传转化的优点
• 1.3.3 影响农杆菌介导的丝状真菌遗传转化效率的因素
• 1.3.4 农杆菌介导的丝状真菌遗传转化在真菌功能基因研究中的应用
• 1.4 本研究的目的意义及技术路线
• 1.4.1 本研究的目的意义
• 1.4.2 本研究的主要内容
• 1.4.3 技术路线
• 第2章 质粒和菌株的构建
• 2.1 材料和仪器
• 2.1.1 菌株、质粒及引物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 分子生物学相关实验方法
• 2.2.2 实验中使用的试剂盒
• 2.2.3 pulAc43 质粒的保存
• 2.2.4 pCAM-ble 质粒构建和保存
• 2.2.5 pCAM-ble 质粒的验证
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 pCAM-ble 质粒的构建
• 2.3.3 pCAM-ble 质粒验证
• 2.4 本章小结
• 第3章 农杆菌介导灰黄青霉的转化
• 3.1 材料和仪器
• 3.1.1 菌株及引物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要培养基
• 3.1.5 实验菌株保存方法
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 筛选转化子所需博莱霉素浓度的确定
• 3.2.2 抑制农杆菌生长所需头孢霉素浓度的确定
• 3.2.3 农杆菌EHA105 的活化和诱导培养
• 3.2.4 灰黄青霉孢子的培养
• 3.2.5 农杆菌转化灰黄青霉过程
• 3.2.6 假定转化子的遗传稳定性分析
• 3.2.7 灰黄青霉菌丝体的培养和收集
• 3.2.8 灰黄青霉基因组DNA 的提取
• 3.2.9 假定转化子的T-DNA 插入的PCR 检测和性状变化的筛选
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 筛选转化子所需博莱霉素浓度的确定
• 3.3.2 抑制农杆菌生长所需头孢霉素浓度的确定
• 3.3.3 农杆菌介导的灰黄青霉转化体系的优化
• 3.3.4 假定转化子基因组的PCR 验证
• 3.3.5 转化子的遗传稳定性分析
• 3.3.6 不同性状突变子的筛选
• 3.4 本章小结
• 第4章 农杆菌介导产黄青霉的转化
• 4.1 材料和仪器
• 4.1.1 菌株及引物
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要培养基
• 4.1.5 产黄青霉菌种的保存
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 筛选转化子所需博莱霉素浓度的确定
• 4.2.2 抑制农杆菌生长所需头孢霉素浓度的确定
• 4.2.3 农杆菌EHA105 的活化和诱导培养
• 4.2.4 产黄青霉孢子的准备
• 4.2.5 农杆菌转化产黄青霉
• 4.2.6 假定转化子的遗传稳定性分析
• 4.2.7 产黄青霉菌丝体的培养和收集
• 4.2.8 假定转化子的T-DNA 插入的PCR 检测
• 4.2.9 不同农杆菌菌株介导的转化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 筛选转化子所需博莱霉素浓度的确定
• 4.3.2 农杆菌介导的产黄青霉转化体系的优化
• 4.3.3 假定转化子基因组的PCR 验证
• 4.4 转化子的遗传稳定性分析
• 4.5 不同农杆菌菌株对转化效率的影响
• 4.6 不同性状突变子的筛选
• 4.7 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢