H1N1、EV71、HBoV和hMPV四种病毒LAMP检测方法的建立

论文摘要

环介导等温扩增（Loop Mediated Isothermal Amplification,LAMP）,是指利用特异性引物在等温反应条件通过扩增酶的协助对模板进行周而复始的扩增过程。对于RNA核酸则为RT-LAMP。这种核酸扩增机制并不需要核酸的变复性,具有扩增时间短、效率高和特异性强等优点。因此,这种技术被更加广泛地应用于分子诊断学中,特别是病原体核酸的诊断。本研究选取近些年广泛关注的病毒:肠道病毒71型（EV71）,与甲型H1N1流感病毒（A H1N1）,还有两种婴幼儿呼吸道病毒:人博卡病毒（HBoV）,人偏肺病毒（hMPV）为研究对象,初步建立了这四种病原的LAMP检测方法。主要获得以下结果:1、通过Align X和Primer Explorer软件得到甲型H1N1四川株LAMP引物,并进行RT-LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为100%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,用RT-PCR作为平行对照的76份临床样本检测结果显示两种方法得到同样的2份阳性样本,且测序结果吻合。初步建立了甲型H1N1流感病毒的实验室LAMP检测方法。2、通过Align X和Primer Explorer软件得到EV71安徽株LAMP引物,并进行RT-LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为98%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,252份临床样本检测中,咽拭子151份,粪拭子101份,检测结果为52份EV71阳性,其中咽拭子40份,粪拭子12份,检测结果与临床原始数据相符。初步建立了肠道病毒71型的实验室LAMP检测方法。3、通过Align X和Primer Explorer软件得到HBoV湖南株LAMP引物,并进行LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为100%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,用RT-PCR作为平行对照的76份临床样本检测结果显示两种方法得到同样的5份阳性样本,且测序结果吻合。初步建立了人博卡病毒的实验室LAMP检测方法。4、通过Align X和Primer Explorer软件得到hMPV湖南株LAMP引物,并进行LAMP反应,研究结果显示产物酶切与理论值相符,测序鉴定结果与模板同源性为98%,不与相关病原体发生交叉反应特异度很高,灵敏度为10拷贝,用RT-PCR作为平行对照的76份临床样本检测结果显示,RT-PCR阳性5份,RT-LAMP阳性7份,且测序结果吻合。初步建立了人偏肺病毒的实验室LAMP检测方法。本研究对甲型H1N1、EV71、HBoV、hMPV四种病毒所建立的LAMP检测方法具有高通量、高时效、易操作等检测优势,同时结果肉眼清晰可见,背景清晰,结果判定客观准确。本研究初步建立了这四种病毒的实验室LAMP检测方法,可以帮助临床快速诊断这四种病毒,便于基层哨点部门第一时间对这四种病毒的监测与防控,尤其是在现场检测中有很广阔的应用前景,为实现现场检测提供了实验室经验与技术支持。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 研究背景
• 1.1 试验相关病毒概述
• 1.2 环介导等温扩增技术的研究进展
• 1.2.1 环介导等温扩增技术概述
• 1.2.2 环介导等温扩增技术的原理及其发展
• 1.2.3 环介导等温扩增技术在病原体基因检测方面的优势与应用
• 1.3 展望
• 试验研究
• 第二章 四种病毒LAMP 检测方法的建立
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验室病毒阳性核酸与临床样本
• 2.1.2 细菌菌株、质粒载体及所用分子试剂
• 2.1.3 所用软件
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 四种病毒阳性核酸的PCR 与LAMP 检测
• 2.2.3 四种病毒LAMP 产物的限制性内切酶酶切鉴定
• 2.2.4 四种病毒LAMP 产物的测序鉴定
• 2.2.5 四种病毒LAMP 的特异度检测
• 2.2.6 四种病毒LAMP 的灵敏度检测
• 2.2.7 四种病毒LAMP 的临床样本检测
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 四种病毒实验室阳性核酸PCR、RT-PCR 检测结果
• 2.3.2 四种病毒的LAMP 检测及产物的酶切鉴定与测序
• 2.3.3 四种病毒LAMP 检测的特异性
• 2.3.4 四种病毒LAMP 检测的灵敏度
• 2.3.5 四种病毒临床样本的检测
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介