琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究

论文摘要

糖水解酶是糖生物学研究的前沿和热点。琼胶酶是一种糖水解酶,在医药、食品等多个领域具有广泛的应用前景。因此,琼胶酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。本实验室从一株海洋假别单胞菌CY24中克隆了一种新的胞外琼胶酶β-AgaA,序列分析显示它属于糖苷水解酶家族GH16。然而,与GH16家族其它琼胶酶不同,首先,β-AgaA水解琼脂糖的主要产物为新琼四糖、六糖及少量二糖;其次,虽然β-AgaA的最小底物为新琼八糖,但其作用模式有两种。因此,无论是降解终产物的特异性还是最小底物的降解模式β-AgaA均具有独特性。为了阐明β-AgaA结构与功能关系,本论文通过序列比对、结构模拟、定点突变等技术对β-AgaA中的一些关键位点进行了分析和探讨。首先,利用生物信息学方法分析了琼胶酶β-AgaA在家族内结构上的共性和特异性。从GenBank数据库中搜索所有的琼胶酶的基因序列或者氨基酸序列,首先利用ClustalW、BioEdit等软件进行比较,结果表明GH16家族的琼胶酶在一级结构上同源性非常低;进而我们将104Y作为模板,利用Espript、HCA等软件进行比对,分析显示GH16家族在二级结构上存在较高的同源性,预示着它们在三级结构上也具有相似的折叠模式。根据以上结构我们使用SWISS-Model、SYBYL-FUGUE软件等进行同源建模,构建了琼胶酶β-AgaA的分子模型;用AutoDock、Ligplot等软件建立了β-AgaA和新琼寡糖底物之间的对位信息,结合一级和二级结构上的同源性分析,推测H71、F185、N103、S182、TH189-190、VVTS109-112等位点可能对酶的催化活性或催化机制有影响作用。为了验证以上位点对酶活性或催化特性是否影响,我们利用定点突变构建了相关位点的突变株并进行了验证。定点突变分别采用了大引物PCR法和Quikchange试剂盒,构建的六个突变体包括:H71N,F185L,N103T,S182I,TH189-190AA和VVTS109-112GCHL。经过重组表达、分离纯化和酶活测定,结果表明TH189-190AA和VVTS109-112GCHL的突变导致了β-AgaA活性几乎全部丧失;而F185L的突变会引起酶活性部分丧失;其他三个突变体活性较野生型无明显差异。进一步经过结构模拟和Ligplot软件分析,我们推测酶与底物结合的-4位点H71和底物之间形成的氢键作用比较弱,所以对酶与底物的亲和没有太多影响,而TH189-190和VVTS109-112可能均位于催化腔中,改变其疏水性和氨基酸侧链后可能导致酶无法与底物结合,从而使酶活丧失。荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）法对突变体酶降解琼脂糖的产物进行了分析,结果表明所预测的突变体均不能改变降解模式,终产物仍然是新琼六糖和新琼四糖。由此我们得出:这些位点的改变不能改变催化腔的结构,因此产物性质没有发生改变。本论文利用生物信息学和定点突变的方法研究了琼胶酶β-AgaA的结构和功能关系,揭示了酶与底物的对位对酶催化活性和作用方式的影响,对琼胶酶甚至糖苷水解酶构效关系研究的深入开展具有指导意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 琼胶与琼胶酶
• 1.1 琼胶
• 1.2 琼胶酶
• 1.2.1 琼胶酶的来源
• 1.2.2 琼胶酶的分类
• 1.2.3 琼胶酶的研究现状
• 1.2.4 琼胶酶的作用机理
• 1.2.5 琼胶酶的催化区和碳水化合物结合区的晶体结构的研究
• 1.2.6 琼胶酶的应用
• 2 蛋白质的结构和功能的关系
• 3 定点突变
• 3.1 寡核苷酸引物介导的定点突变
• 3.2 PCR介导的定点突变法及其改进——大引物突变法
• 3.3 盒式突变
• 3.4 三种方法的优缺点比较
• 3.4.1 寡核苷酸引物介导的定点突变法
• 3.4.2 PCR介导的定点突变法
• 3.4.3 盒式突变
• 4 前期工作与展望
• 第一章 琼胶酶β-AgaA的结构研究
• 1 实验工具和实验方法
• 1.1 部分模板分子的结构和功能分析
• 1.1.1 模板分子中104Y和104Z介绍
• 1.1.2 模板分子中1URX的介绍
• 1.2 序列相似性搜索-BLASTp
• 1.3 模体搜索
• 1.4 多重序列比对ClustalW
• 1.5 ESpript（Easy Sequencing in Postscript）和疏水簇分析（hydrophobic cluster analysis,HCA）比对
• 1.6 SWISS-Model（www.expasy.org/swissmod/SWISS-MLDEL.html）模拟构建β-AgaA的结构
• 1.7 AutoDock和Ligplot分析酶与底物形成氢键和疏水作用的残基
• 2 实验结果
• 2.1 序列相似性搜索-BLASTp
• 2.1.1 BLASTp对SWISS-PROT蛋白序列数据库搜索结果
• 2.1.2 BLASTp对布鲁克海文PDB蛋白结构数据库搜索结果
• 2.2 保守结构域（conserved domain）搜索
• 2.3 多重序列比对ClustalW
• 2.4 ESpript（Easy Sequencing in Postscript）和疏水簇分析（hydrophobic cluster analysis,HCA）比对
• 2.5 根据模拟的三维结构预测关键氨基酸位点
• 2.6 AutoDock和Ligplot分析酶和底物的对位信息
• 3 讨论
• 第二章 氨基酸突变实验
• 1 材料与仪器
• 1.1 仪器
• 1.2 菌株与质粒
• 1.3 试剂
• 1.4 常用缓冲液及溶液
• 2 实验方法
• 2.1 大引物PCR法定点突变
• 2.1.1 PCR引物设计
• 2.1.2 PCR介导的定点突变
• 2.2 QuikChange定点突变
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 定点突变反应
• 2.3 感受态细胞的制备
• 2.4 突变产物的转化
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第三章 突变体酶性质的研究
• 1 材料与仪器
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 常用缓冲液及溶液
• 2 实验方法
• 2.1 突变体酶的表达
• 2.2 DNS法测定突变体发酵液上清酶活筛选
• 2.3 突变体酶的分离纯化
• 2.4 突变体酶比活力的测定
• 2.5 突变体酶降解产物的鉴定
• 2.6 突变体酶的其它生化性质
• 3 实验结果
• 3.1 突变体的纯化
• 3.2 突变体的比活力
• 3.3 突变体酶降解琼脂糖的产物分析
• 3.4 突变体酶的其它生化性质
• 4 讨论
• 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间撰写的论文