养殖鱼肠道菌群分子生态的研究

论文摘要

鱼肠道存在着大量的微生物群落,构成了鱼肠道微生物区系,这些微生物群落是鱼类长期进化的结果,它们和机体的免疫功能、营养需求等都有着密切的关系。微生物生态的监测及其群落多样性分析是微生物生态学研究所采用的重要技术手段和内容。基于核酸序列分析的现代分子生物学技术可以用来检测不可培养微生物的种类,完善微生物的分类系统,从而更真实的反映环境微生物的群落结构。为了分析养殖鱼肠道菌群结构的影响因素,本研究应用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)对其进行了研究。分析比较江苏盐城大丰和射阳地区鲫鱼肠道壁、肠道内容物、饵料、池塘底泥、水样细菌菌群结构:通过DGGE图谱和UPGMA聚类分析结果显示养殖鲫鱼肠道细菌菌群结构受水环境、底泥、饵料微生物影响,且水环境影响较为突出。因此,饵料相同条件下环境因素是影响鲫鱼肠道细菌菌群结构组成的主要因素。进一步分析比较不同配合饲料对草鱼肠道菌群结构的影响。其中以肠衣粉和豆粕作为蛋白源的比较结果发现肠衣粉组菌群结构更加丰富,可能与不同蛋白来源的氨基酸组成有关;不同磷脂水平饲喂的草鱼肠道菌群结果比较基本一致,可能由于添加磷脂对草鱼肠道菌群没有明显影响,而更有利于草鱼对脂肪的消化吸收从而促进生长;对于菜粕和棉粕作为杂粕的添加比例中单一添加棉粕或菜粕对肠道菌群组成具有明显的影响;不添加或者加量添加玉米部分替代次粉作为能量源对于草鱼肠道菌群结构有明显影响;DDGS及麦芽根两种饲料填充剂的不同添加比例对于肠道菌群结构影响不大。基于16S rDNA序列比对分析发现,鲫鱼肠道中主要定植菌群为浮霉菌门、变形菌门、壁厚菌门、梭杆菌门及未分类细菌;而草鱼肠道主要定植细菌属于壁厚菌门、变形菌门、浮霉菌门、蓝菌门和未分类细菌,与所报道的肠道菌群结构基本一致。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 鱼类肠道菌群的形成
• 1.2 鱼类肠道菌群的组成及数量
• 1.3 鱼类肠道菌群的生理功能
• 1.3.1 营养功能
• 1.3.2 防御功能
• 1.4 消化道菌群结构研究手段
• 1.4.1 核糖体16S RNA技术
• 1.4.2 遗传指纹技术（DNA Fingerprint Techniques）
• 1.4.2.1 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 1.4.2.2 单链构象多态性（SSCP）
• 1.4.2.3 末端限制性片段长度多态性（TRFLP）
• 1.4.2.4 随机扩增多态性分析（RAPD）
• 1.4.3 核酸分子杂交技术
• 1.4.3.1 斑点（Dotblot）杂交（点渍杂交）
• 1.4.3.2 荧光原位杂交技术（FISH）
• 1.4.3.3 基因芯片技术（DNA Microarrays）
• 1.4.4 实时荧光定量PCR技术（Real-time PCR）
• 1.4.5 微生物群落功能多样性的研究
• 1.4.5.1 宏基因组文库（Metagenomic Libraries）
• 1.4.5.2 环境基因组标签法（EGTs）
• 1.5 问题与展望
• 第二章 不同养殖环境对鲫鱼肠道菌群的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 菌种和质粒
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 仪器和试剂
• 2.1.5 溶液
• 2.1.6 培养基
• 2.1.7 鲫鱼肠道的处理
• 2.1.8 水体样品菌体收集
• 2.1.9 总DNA的提取
• 2.1.10 PCR扩增
• 2.1.11 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 2.1.11.1 DGGE电泳凝胶制备
• 2.1.11.2 DGGE电泳
• 2.1.11.3 DGGE电泳条件
• 2.1.12 DNA片段的回收和连接
• 2.1.12.1 电泳
• 2.1.12.2 回收
• 2.1.12.3 DNA片段的连接
• 2.1.13 感受态细胞的制备
• 2.1.14 电转化
• 2.1.14.1 重组DNA的纯化
• 2.1.14.2 转化
• 2.1.14.3 重组子筛选
• 2.1.15 DNA测序
• 2.1.16 DGGE图谱中部分优势条带的序列分析和系统发育分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 2.2.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 2.2.3 部分优势条带的序列比对与系统发育树分析
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 第三章 草鱼肠道菌群营养分子生态的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 样品采集及饲料成分
• 3.1.2 菌种和质粒,工具酶,仪器和试剂,溶液,培养基
• 3.1.3 草鱼肠道的处理
• 3.1.4 总DNA的提取
• 3.1.5 PCR扩增
• 3.1.6 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 3.1.7 DNA片段的回收和连接,感受态细胞的制备,电转化,重组子筛选
• 3.1.8 DNA测序
• 3.1.9 DGGE图谱中部分优势条带的序列分析和系统发育分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 肠衣粉替代豆粕对草鱼肠道菌群的影响
• 3.2.1.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 3.2.1.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 3.2.1.3 部分优势条带的序列比对与系统发育树分析
• 3.2.1.4 讨论
• 3.2.2 高能饲料对草鱼肠道菌群的影响
• 3.2.2.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 3.2.2.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 3.2.2.3 部分优势条带的序列比对与系统发育树分析
• 3.2.2.4 讨论
• 3.2.3 棉粕替代菜粕对草鱼肠道菌群的影响
• 3.2.3.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 3.2.3.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 3.2.3.3 部分优势条带的序列比对与系统发育树分析
• 3.2.3.4 讨论
• 3.2.4 饲料中玉米添加水平对草鱼肠道菌群的影响
• 3.2.4.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 3.2.4.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 3.2.4.3 部分优势条带的序列比对与系统发育树分析
• 3.2.4.4 讨论
• 3.2.5 DDGS替代麦芽根对草鱼肠道菌群的影响
• 3.2.5.1 总DNA的提取及PCR扩增
• 3.2.5.2 DGGE指纹图谱建立及分析
• 3.2.5.3 部分优势条带的序列比对与系统发育树分析
• 3.2.5.4 讨论
• 3.3 本章小结
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢