TRPC通道参与U-87细胞缺氧诱导的VEGF表达的研究

论文摘要

研究背景恶性多形性神经胶质细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是最常见的恶性脑部肿瘤。GBM患者通常预后很差,是癌症相关死亡的主要原因。这一类型肿瘤呈现高度血管依赖性。通常,神经胶质瘤恶性程度越高,则血管化程度越高。许多生长因子可以调节肿瘤血管生成,包括:成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factors,FGF）,血管内皮生长因子（Vascular endothelia growthfactors,VEGF）,内皮生长因子（Endothelial growth factors,EGF）和转化生长因子（Transforming growth factors,TGF-β）等。其中,VEGF是最重要的实体瘤血管生成因子。VEGF可促进血管内皮细胞增殖,导致血管生成。缺氧是GBM的显著特征,同时也是一个已知的可诱导VEGF表达的重要因素。人们发现,GBM坏死区周围存在高度缺氧的区域（pseudopalisading region）,该区细胞表达高水平的VEGF。VEGF表达的调节是复杂的,涉及到多个不同的水平,包括:VEGF转录增加,VEGF mRNA的稳定,VEGF蛋白的分泌和扩散。在大多数细胞,缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor,HIF-1α）是调节VEGF表达的关键转录因子。缺氧情况下,HIF-1α蛋白增加且转录活性升高。它与HIF-1β形成异源二聚体,与VEGF启动子区结合,介导VEGF表达。通常,转录因子直接调控下游靶基因表达。然而,离子通道可能在更上游的水平发挥调节基因表达的作用。嗜铬细胞瘤细胞系（PC12）是一个公认的可兴奋的氧感受细胞;缺氧可以抑制氧敏感的钾离子通道（Kv1.2）,细胞因此产生去极化;Kv1.2的失活过程密切耦联于HIF-1靶基因酪氨酸羟化酶（Tyrosinehydroxylase）的表达。此外,非选择性阳离子通道（non-selective cation channels）也参与缺氧信号转导通路。严重缺氧联合葡萄糖剥夺（prolonged oxygen andglucose deprivation）激活TRPM7-ROS正反馈通路,介导钙超载事件,引起神经元坏死。中等程度缺氧（1%）条件下,Yamaji等发现非选择性阳离子通道参与缺氧诱导的内皮细胞糖酵解甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）表达。缺氧暴露时,非选择性阳离子通道被激活,通透钙离子导致星形胶质细胞胞内钙浓度升高,而钙是重要的基因表达的调节者。非选择性离子通道包括很多成员:TRP通道（transient receptor potentialchannels）,钙激活的非选择性通道（calcium activated non-selective channels）,超极化激活的阳离子通道（hyperpolarization activated cation currents）,酸感受离子通道（acid-sensitive cationic channels,ASIC）等等。其中TRP是近年来的研究热点。TRP离子通道超家族至少包括TRPC（TRP-canonical）,TRPV（TRP-vanilloid）和TRPM（TRP-melastatin）亚家族。尽管以前的实验通过通道阻断剂La3+或者Gd3+证实非选择性阳离子通道参与细胞的缺氧反应性。但是这些通道阻断剂是非特异性的,可能对整个非选择性阳离子通道的成员都有作用（阻断或激活）,因此无法确定参与缺氧反应的具体分子。本研究主要关注TRPC离子通道。TRPC通道是一个重要的TRP通道成员,可以感受多样性的外界刺激。人类细胞表达六个TRPC亚型（TRPC1-7）,除了TRPC2（在人类是假基因）。通过联合使用药理学以及细胞分子生物学方法,我们确认了一个特异性的TRPC亚型,TRPC1,参与缺氧诱导的U-87细胞VEGF表达。目的本研究联合使用多种细胞生物学和分子生物学方法:MTT,hoechst染色,real-time RT-PCR,western blot,免疫荧光技术,RNA干扰,过表达,钙浓度测定方法等,探讨TRPC在缺氧诱导的U-87细胞VEGF表达中的作用。方法1.通过MTT、Hoechst、western blot和real-time RT-PCR方法,分析低氧（1%O2）不同时间点细胞凋亡、增殖、缺氧诱导因子1α（HIF-1α）以及VEGF表达情况,以建立神经胶质细胞瘤细胞系U-87体外缺氧诱导VEGF表达的模型。2.通过real-time RT-PCR,观察TRPC通道阻断剂SKF96365对缺氧诱导的VEGF表达的影响,以确定TRPC通道是否参与缺氧诱导的VEGF表达。3.采用RT-PCR,检测常氧情况下不同TRPC通道亚型在U-87细胞上的表达情况。4.使用激光共聚焦显微镜,观察加入TRPC通道激动剂OAG以及阻断剂2-APB时细胞内Ca2+的动态变化,以确定U-87细胞上的TRPC通道是否是功能性的。5.使用real-time RT-PCR,观察并分析缺氧后TRPC通道各亚型的表达情况,以确定下一步需要使用的分子生物学策略:过表达或RNA干扰。6.通过RNAi下调TRPC1表达。分别用real-time RT-PCR和ELISA检测VEGFmRNA和蛋白水平的变化,观察下调TRPC1对缺氧诱导的VEGF上调的影响。7.通过瞬时转染野生型TRPC3或TRPC5质粒增加TRPC3或TRPC5表达。观察TRPC3和TRPC5对缺氧诱导的VEGF表达的影响。8.通过免疫荧光技术,使用激光共聚焦显微镜观察缺氧是否引起TRPC1胞内转位变化。结果1.Hoechst结果显示:缺氧（1%O2）24h或48h不导致细胞凋亡;缺氧24h仅轻微减少了细胞增殖（下降3.23%）,而缺氧48h细胞出现明显的增殖抑制（减少22.35%,P＜0.001）;缺氧（1%O2）诱导HIF-1α增加;缺氧10h显著诱导VEGF表达（升高4.24倍,P＜0.01）。2.TRPC通道阻断剂SKF96365可明显抑制缺氧U-87细胞VEGF表达。25μMSKF96365抑制了VEGF mRNA水平的上调（P＜0.01）,且增加SKF96365的浓度进一步抑制VEGF表达。3.常氧条件下,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,检测到四个单一条带,大小为168bp,112bp,119bp,159bp（与预期的产物大小一致）,分别对应于TRPC1,TRPC3,TRPC4和TRPC5亚型。4.TRPC通道激动剂OAG可增加胞内Ca2+浓度,而TRPC通道阻断剂2-APB可抑制激动剂诱导的胞内Ca2+浓度增加。5.缺氧后,U-87细胞TRPC3和TRPC4亚型表达分别减少67.7%,68.2%（P＜0.05）。此外,高敏感的荧光定量PCR无法检测到缺氧U-87细胞TRPC5亚型转录本。另一方面,常氧和缺氧胶质瘤细胞TRPC1的表达保持稳定,并不发生明显减少。6.化学合成的siRNA显示出高度的细胞传输效率（超过90%）;三个TRPC1特异性的siRNAs:siRNA-1,siRNA-2和siRNA-3分别减少TRPC1 mRNA到64%,39%和36%（P＜0.01）;分别减少TRPC1蛋白到阴性对照组的48%,29%和33%（P＜0.01）。siRNA-2和siRNA-3显著抑制了缺氧诱导的VEGF基因上调（P＜0.01）。同时培养基中分泌的VEGF也发生类似的变化（P＜0.01）。7.通过瞬时过表达TRPC3或TRPC5增加了缺氧情况下U-87细胞TRPC3或TRPC5的表达水平。但过表达这些TRPC野生型质粒DNA既不促进缺氧U-87细胞VEGF表达,也不减弱VEGF表达（P＞0.05）。8.常氧条件下,TRPC1通道分布于胞膜及胞浆。然而缺氧后,胞浆区TRPC1荧光明显减少,而细胞膜出现强烈的荧光信号。结论1.1%O2是人体内实体肿瘤低氧环境的氧气浓度。体外的缺氧实验证实该氧气浓度作用24h不能诱导显著的细胞凋亡且仅轻微抑制细胞增殖,但延长缺氧暴露时间至48h可导致细胞增殖抑制。说明1%O2作用小于24h可能是合适的体外诱导U-87细胞VEGF表达的模型。进一步,缺氧（1%O2）可增加HIF-1α蛋白水平,并显著诱导VEGF上调。2.TRPC通道阻断剂可抑制缺氧U-87细胞VEGF表达,说明TRPC通道可能参与缺氧诱导的VEGF表达。3.常氧条件下,U-87细胞共表达四个TRPC通道亚型,分别为:TRPC1,TRPC3,TRPC4和TRPC5。4.对TRPC通道激动剂和阻断剂的反应性,说明U-87细胞上TRPC通道是功能性的。5.缺氧后TRPC3,4,5亚型表达量显著减少,而TRPC1表达保持不变。说明相对于其他TRPC亚型,TRPC1可能在胶质瘤细胞缺氧信号通路中扮演不同的角色。并提示下一步针对缺氧抑制表达的TRPC亚型,可采用过表达方法;而针对TRPC1,则采用RNA干扰技术。6.通过RNAi下调TRPC1表达可抑制缺氧诱导的VEGF基因表达,此外,分泌型VEGF也受到抑制。说明TRPC1参与缺氧诱导的VEGF表达。7.过表达可显著增加TRPC3或TRPC5亚型表达。但过表达这些TRPC野生型质粒DNA既不促进缺氧U-87细胞VEGF表达,也不减弱VEGF表达。说明TRPC3或TRPC5不参与缺氧诱导的VEGF上调过程。8.缺氧诱导TRPC1细胞膜转位,说明缺氧条件下,TRPC1可能通过转位而被激活,参与缺氧诱导的VEGF表达。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 研究背景
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 博士期间发表论文
• 致谢
• 统计学证明