反义TIMP-1对实验性肝纤维化影响的研究

论文摘要

背景与目的:肝纤维化的主要特征是肝脏内细胞外基质（ECM）的生成和降解的失衡,调节ECM合成、降解的一个重要环节是基质金属蛋白酶-基质金属蛋白酶抑制因子（MMPs-TIMPs）系统,其中间质胶原酶MMP-1（人）/MMP-13（鼠）及其抑制因子（TIMP-1）为最重要平衡因子。在正常肝脏中,MMP-1（人）/MMP-13（鼠）与TIMP-1维持着平衡统一的状态,一旦两者作用失衡,TIMP-1的作用增强,过度抑制MMP-1（人）/MMP-13（鼠）的降解作用,使ECM沉积增多,从而促进肝纤维化的发生发展。国内外学者一致认为:肝纤维化过程中TIMP-1表达增高、抑制了MMPs的活性,可促进肝纤维化的发展,因此抑制TIMP-1的表达也是阻止肝纤维化发生、发展的重要环节。本研究旨在构建反义TIMP-1真核细胞表达质粒,以脂质体包埋后将其导入大鼠肝纤维化模型并获得有效表达,以观察外源治疗性质粒的疗效,探讨基因治疗肝纤维化的可行性及有效性,为今后临床肝纤维化的基因治疗提供理论依据。 材料与方法: 1、反义质粒的构建:以Trizol Reagent抽提肝组织中总RNA,采用套式引物,以逆转录巢式PCR的方法扩增TIMP-1目的片段并经测序鉴定,双酶切纯化TIMP-1 PCR产物及PCDNA3.1（+）真核细胞表达质粒,再将TIMP-1目的片段反向插入PCDNA3.1（+）线性质粒,即构建成反义TIMP-1/PCDNA3.1（+）真核细胞表达质粒; 2、反义质粒的鉴定:酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序分析证实质粒构建是否成功; 3、肝纤维化模型的复制及干预治疗:以复合因素（40%CCl4 3ml/kg皮下注射,每隔4天一次,首剂加倍:15%酒精为唯一饮用品;饮食采用高脂高胆固醇复合饲料）SD大鼠随机分为正常对照组（12只,N）,四氯化碳攻击组（52只）,两周后将攻击组剩余大鼠（49只）随机分为肝纤维化组（19只,C）、空质粒组（19只,P）、反义TIMP-1/PCDNA3.1（+）治疗组（11只,AT）（后简称反义TIMP-1质粒组）;继续造模,40%四氯化碳植物油溶液皮下注射,前后共11次,第52天结束注射,空质粒组、反义TIMP-1质粒组同期给予腹腔注射脂质体包埋后的PCDNA3.1（+）、TIMP-1/PCDNA3.1（+）质粒50ug,每隔9天注射一次,共注射4次,最后一次40%四氯化碳攻击后2天宰杀实验动物,取剩余N组（12只）、AT组（11只）、C组（11只）、P组（10只）肝组织; 4、结果观察:应用苏木素—伊红染色（HE）、苦味酸—酸性复红染色（VG）观察肝组织病理形态学变化,进行肝纤维化分级,应用免疫组织化学SABC法观察肝组织中TIMP-1、MMP-13及Ⅲ型胶原的表达,并应用计算机图像分析技术半定量监测其蛋白表达的强弱。实验结果采用SPSS软件作单因素方差分析（多样本均数的两两比较）,病理学形态分级结果作Ridit检验;

论文目录

• 第一部分 反义TIMP-1真核细胞表达质粒的构建
• 材料与方法
• 1 材料与试剂
• 2 主要实验仪器
• 3 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 反义TIMP-1真核细胞表达质粒对实验性肝纤维化的影响
• 材料与方法
• 1 材料与试剂
• 2 主要实验仪器
• 3 方法
• 结果
• 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 作者简介