苡米化积益肝煎对H22瘤细胞Bcl-2、CasPase-3蛋白表达的影响及意义

论文摘要

背景:国内外研究已经证实细胞凋亡与肿瘤的发生有着非常密切的关系,细胞凋亡与增殖失控是肿瘤发生发展的重要因素之一。肿瘤的发生与控制细胞增殖的癌基因过度表达有关,也与抑制细胞凋亡基因的高表达及诱导细胞凋亡的抗癌基因变异失活有关。细胞凋亡过程被不适当的终止是细胞癌变的重要前提,凋亡过程的受抑对肿瘤的发生发展起重要作用。1972年,Kerr等[1]提出细胞凋亡的概念:细胞凋亡（apoptosis）又谓细胞程序化死亡（programmed cell death, PCD）是一种参与了生物体许多过程的细胞去除机制,是由基因编程调控的细胞主动自杀过程。生物体通过这种机制完成对衰老细胞和畸形细胞的清除。另外细胞凋亡对胚胎发育、免疫耐受、细胞群体稳定等有重大影响,并且对进一步深入研究艾滋病、癌症等对人类的生存构成严重威胁的疾病有潜在的应用价值。因此,许多年以来细胞凋亡一直是生物领域科研研究的热点。细胞凋亡的过程非常复杂,与此有关的两大家族CasPase,Bcl-2对细胞凋亡的调控起着举足轻重的作用。CasPase是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶,它们的一个重要共同点是特异地断开天冬氨酸残基后的肽键。CasPase一词是从Cysteine aspartic acic specific protease的字头缩写衍生而来。迄今,已发现14种哺乳动物的CasPase酶,这些酶以休眠的酶原状态存在,在特定的条件下经过处理变为有催化活性的成熟酶。基于底物特异性和细胞功能,CasPase可被分为3组:Ⅰ炎症组:Caspase1、4、5、11、12、13、14;Ⅱ凋亡启始组:CasPase6、8、9、10;Ⅲ凋亡效应组: Caspase2、3、7。细胞凋亡的发生是一个复杂的CasPase家族参与引导的蛋白酶级联反应过程,尽管对于不同的细胞或不同信号传导途径诱发的凋亡过程中参与的CasPase有所不同,但Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路,也是凋亡的关键酶和执行者,CasPase-3是凋亡的中心效应分子[2]。Bcl-2家族在细胞凋亡过程中起着调节者的作用,共有三个亚族。其中原生存亚族（Prosurvival subfamily）即Bcl-2亚族成员包括Bcl-2,Bcl-CL,KS-Bcl-2,Bcl-W,MCL-1,BHRF1,NR-B,ORF16,LMW5-HL,AL,FIB-19K及CED-9;两个原凋亡家族（Proapoptotrc subfamily）是Bax and BH3亚族。Bax、bak、bid及egl-1属BH3亚族。Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤∕白血病-2基因）是一种原癌基因,它具有抑制凋亡的作用,编码的Bcl-2蛋白过度表达可抑制细胞凋亡,促进肿瘤发生[3]。在细胞毒性T细胞中,由颗粒酶B激活CasPase家族的一个或多个半胱氨酸蛋白酶所诱导的凋亡不依赖于Bcl-2,颗粒酶B可能仅作用于凋亡路径中Bcl-2调节位点的下游。以上结果表明在凋亡途径中Bcl-2的作用位点在信号分子和效应蛋白酶之间的位置[4]。目前对于Bcl-2和CasPase-3研究提示二者的抑制作用是相互的,Bcl-2可抑制CasPase-3的激活,同时Bcl-2又是活化的CasPase-3的底物之一。激活的CasPase-3可降解Bcl-2蛋白,使其表达下降。组织中Bcl-2表达的高低可间接反映CasPase-3的活性,即反映细胞凋亡的程度。目前,有关中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究主要集中在分子调控机制等方面。苡米化积益肝煎是中国传统医学抗癌的验方,尤其是针对原发性肝癌及转移癌。鉴于此,本实验利用分子生物学的方法,通过检测CasPase-3和Bcl-2的表达,研究其抑制腋下实体瘤荷瘤模型小鼠肿瘤及机制,同时探讨中药复方抗肿瘤的分子机制。目的:通过在应用了苡米化积益肝煎抑制肝癌生长及转移,提高了生存质量的荷瘤小鼠中检测CasPase-3和Bcl-2的水平,探讨苡米化积益肝煎抑制小鼠肝癌的作用机制。方法:采用随机法将小鼠分为荷瘤对照组、正常对照组、中药治疗组和5氟尿嘧啶化疗治疗组;建立小鼠腋下实体瘤荷瘤模型,运用免疫组织化学方法检测各组原发瘤CasPase-3和Bcl-2的蛋白表达水平,运用统计学分析数据意义。结果:5氟尿嘧啶化疗组和中药治疗组中CasPase-3的蛋白表达水平均明显高于正常对照组（P<0.01）;5氟尿嘧啶化疗组和中药治疗组中CasPase-3的蛋白表达水平明显高于荷瘤对照组（P<0.01）;5氟尿嘧啶化疗组、中药治疗组CasPase-3的蛋白阳性表达率比较,差异无统计学意义。荷瘤对照组中Bcl-2蛋白表达水平最高,明显高于正常对照组,有显著差异（P<0.01）;5氟尿嘧啶化疗组和中药治疗组中Bcl-2蛋白表达水平均高于正常对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;5氟尿嘧啶化疗组和中药治疗组中Bcl-2蛋白表达水平明显高于荷瘤对照组（P<0.01）;5氟尿嘧啶化疗组、中药治疗组Bcl-2蛋白阳性表达率比较,差异无统计学意义。结论:目前CasPase酶家族已经发现了14个成员,但不是所有CasPase酶都参与凋亡反应,只有CasPase-3、CasPase-6、CasPase-7是具体执行细胞凋亡的酶,其中CasPase-3处于核心地位。Bcl-2蛋白位于核膜、内质网膜和线粒体膜等细胞膜结构上,其中在线粒体外膜上分布最多,是调节细胞凋亡的酶,CasPase-3的蛋白表达水平的上调和Bcl-2蛋白表达水平的的下移共同促进细胞凋亡。苡米化积益肝煎有较强的抗肝癌作用,中药治疗组CasPase-3蛋白表达水平明显升高,而Bcl-2蛋白表达水平明显降低,我们可以推断:苡米化积益肝煎的抗肝癌作用是通过凋亡机制,上调CasPase-3蛋白表达水平并下移Bcl-2蛋白表达水平来促进肿瘤细胞凋亡,从而使瘤体变性坏死起到抗癌的作用。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• （九） 附图
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢