大黄鱼HSP及caspase家族部分基因对温度胁迫的响应

论文摘要

大黄鱼是我国最重要的海水养殖鱼类之一，具有重要的经济价值。大黄鱼在生长发育过程中广泛受到各种环境因子的胁迫，其中，温度作为最重要的环境因子之一，在生产中已经表现出对大黄鱼的生长、发育、抗病、免疫等方面具有明显的影响。但是，温度胁迫对大黄鱼的影响及其响应温度胁迫的机理目前尚不清楚。本文检测了低温（10℃）和高温（35℃）胁迫后大黄鱼部分免疫指标的变化，并利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼热休克蛋白（HSP）家族部分基因HSP27、HSP30、HSP47、HSP90及caspase家族部分基因caspase-1、caspase-7的全长cDNA序列，解析了它们的基因组结构，采用Real-time PCR方法检测了它们的组织表达谱以及在响应温度胁迫过程中的表达变化，并采用大肠杆菌（E. coli）对部分基因进行了原核表达，结果如下：（1）10℃及35℃胁迫2h后，血清溶菌酶活性在恢复正常水温6h-12h都显著低于对照组，在24h开始恢复正常值；温度胁迫对血清SOD活力没有显著影响，而使血细胞中SOD活力、血清免疫球蛋白、白蛋白含量增加，分别在不同时间达到峰值。提示温度胁迫对大黄鱼的非特异性免疫力造成很大的影响。（2）大黄鱼HSP27基因全长cDNA序列为1227bp，ORF为612bp，编码203个氨基酸；HSP30基因全长cDNA序列为851bp，ORF为624bp，编码207个前体氨基酸。序列分析显示，HSP27、HSP30均含有一个HSP23超家族结构域。大黄鱼HSP27基因组包含3个外显子和2个内含子。Real-time PCR检测显示，大黄鱼HSP27基因在心脏中表达丰度最高，其次是肌肉。温度胁迫实验结果表明，30℃胁迫可以诱导肌肉、心脏中HSP27转录水平表达量显著升高（P<0.05）。采用大肠杆菌对该基因进行了重组表达，得到了其可溶性的重组蛋白，为进一步深入研究其功能奠定了基础。（3）大黄鱼HSP47基因全长cDNA为2027bp，ORF为1218bp，编码405个前体氨基酸。在编码区序列中，具有显著的SERPIN超家族结构域。大黄鱼HSP47基因组包括6个外显子和5个内含子。定量PCR结果显示，大黄鱼HSP47基因在脾脏、心脏、肝脏、鳃中表达量较高。高温胁迫（25℃、30℃）可以诱导肝脏、心脏、肌肉中HSP47转录表达显著升高（P<0.05）。采用大肠杆菌对HSP47基因进行了原核表达，初步获得了重组表达的蛋白。（4）获得了2715bp的大黄鱼HSP90全长cDNA序列，ORF为2178bp，编码725个氨基酸。序列分析表明，大黄鱼HSP90包含HATPasec结构域和HSP90超家族结构域。基因组序列包含11个外显子和10个内含子。定量PCR显示，大黄鱼HSP90在肝脏、血液中表达量较高，而且除25℃外，高温和低温胁迫均能引起肌肉组织中HSP90转录水平表达的显著升高（P<0.05）。（5）大黄鱼caspase-1基因全长cDNA序列为1780bp，ORF为1167bp，编码388个氨基酸。氨基酸序列分析显示：该序列包含典型的CARD结构域、CASPASEP20结构域、CASPASEP10结构域和高度保守的催化活性中心QACRG。定量PCR结果显示，caspase-1在血液、头肾、心脏、肝脏等组织中表达量较高。温度胁迫实验表明，10℃、15℃胁迫后，肝脏、心脏中caspase-1表达量显著升高（P<0.05），而25℃、30℃胁迫后，表达量降低，在心脏中的变现尤其显著（P<0.05）。初步获得了大黄鱼caspase-1的原核重组表达蛋白。（6）大黄鱼caspase-7基因全长cDNA序列为1392bp，ORF为900bp，编码299个氨基酸。氨基酸序列分析表明：caspase-7含有CASPASEP20和CASPASEP10结构域，没有发现典型的原域结构，符合其执行caspase的特点，在大亚基单位中具有caspase高度保守的催化活性中心QACRG。基因组结构分析表明，大黄鱼caspase-7基因组包含有7个外显子和6个内含子。定量PCR结果显示，caspase-7在肌肉、头肾、心脏中含量较高。温度胁迫实验结果显示：高温使心脏caspase-7显著升高（P<0.05），低温使得肝脏中caspase-7显著升高（P<0.05），而高温、低温皆使头肾中caspase-7表达量显著降低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 大黄鱼养殖现状
• 1.2 研究背景
• 1.3 热休克蛋白研究进展
• 1.3.1 热休克蛋白的分类与特点
• 1.3.2 热休克蛋白的生物学功能
• 1.3.3 热休克蛋白在生物机体中的表达
• 1.4 caspase 家族基因的研究进展
• 1.4.1 caspase 的结构与分类
• 1.4.2 caspase 在细胞凋亡中的作用
• 1.4.3 caspase 在鱼类中的研究
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 温度胁迫对大黄鱼血液免疫指标的影响
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验用鱼
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 温度刺激方案
• 2.2.2 样品制备
• 2.2.3 总蛋白含量测定
• 2.2.4 血清溶菌酶活性的测定
• 2.2.5 血细胞及血清中 SOD 酶活力的测定
• 2.2.6 血清免疫球蛋白及白蛋白含量测定
• 2.2.7 数据处理
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 大黄鱼血清溶菌酶活性的变化
• 2.3.2 大黄鱼血细胞及血清中 SOD 酶活力的变化
• 2.3.3 大黄鱼血清免疫球蛋白及白蛋白的变化
• 2.4 讨论
• 第3章 大黄鱼热休克蛋白（HSP）家族部分基因的克隆与表达研究
• 3.1 大黄鱼 sHSP 家族基因 HSP27、HSP30 的克隆与表达
• 3.1.1 大黄鱼 HSP27、HSP30 基因的克隆与表达分析
• 3.1.2 大黄鱼 HPS27 基因的原核重组表达
• 3.2 大黄鱼 HSP47 基因的克隆与表达
• 3.2.1 大黄鱼 HSP47 基因的克隆与表达分析
• 3.2.2 大黄鱼 HPS47 基因的重组表达
• 3.3 大黄鱼 HSP90 基因的克隆与表达
• 3.3.1 实验材料
• 3.3.2 实验方法
• 3.3.3 实验结果
• 3.3.4 讨论
• 第4章 大黄鱼 caspase 家族部分基因的克隆与表达研究
• 4.1 大黄鱼 caspase-1 基因的克隆与表达
• 4.1.1 大黄鱼 caspase-1 基因的克隆
• 4.1.2 大黄鱼 caspase-1 基因的重组表达
• 4.2 大黄鱼 caspase-7 基因的克隆与表达
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 实验结果
• 4.2.4 讨论
• 第5章 总结与展望
• 5.1 总结
• 5.2 创新与展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文