多年生黑麦草再生体系的建立及农杆菌介导AVP1基因的导入

论文摘要

多年生黑麦草（Lolium perenne L.）是国内外广泛应用的重要冷季型禾草之一。利用基因工程进行遗传改良的研究一直备受人们关注。本研究以多年生黑麦草（Lolium perenne L.）的三个品种:里加（Regal）、贝尔勒（Belle）、马拉松（Marathon）为研究对象,建立了高效的遗传转化体系,研究结果表明:（1）建立了多年生黑麦草的再生体系。以多年生黑麦草的芽尖、根尖、下胚轴、成熟种子为外植体进行了愈伤组织诱导和分化的研究,通过不同处理结果的比较表明,不同划割处理的成熟种子的愈伤组织诱导率不同,不同外植体的愈伤组织诱导率也不同,芽尖、根尖愈伤组织的诱导效果较差,纵向划割的成熟种子的愈伤组织的诱导率及分化能力均优于下胚轴;2,4-D浓度在5-7 mg/L,6-BA浓度为0.05-0.1 mg/L时有利于成熟种子和下胚轴诱导产生愈伤组织;在分化培养基中添加0.5-1.0mg/L6-BA对愈伤组织的分化效果较好;继代培养时间对愈伤组织的分化率有很大影响,成熟种子和下胚轴在继代培养基上继代培养60d和80d时分化率最高,继代天数过长不利于愈伤组织的生长。（2）农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化体系的建立与优化。通过对实验现象的观察和数据的统计分析表明,将预培养4d的黑麦草的胚性愈伤组织经OD600=0.6左右的农杆菌菌液在负压下浸染6min,共培养3d,用250mg/L的羧苄青霉素（Carb）来脱菌,附加150μmol/L的乙酰丁香酮（AS ）,然后转接到含75mg/L的潮霉素的筛选培养基上进行筛选培养的转化体系效果最佳。（3）目的基因AVP1的转化及对转基因植株的初步鉴定。将所得抗性愈伤组织转接到含250mg/L的羧苄青霉素和75mg/L的潮霉素的分化培养基上进行诱导分化,然后在1/2MS的生根培养基上使其再生成苗。最后,对转基因植株进行AVP1基因中间片段及全长的PCR检测,结果显示黑麦草三个品种均没有获得转基因植株。表明目的基因没有整合到多年生黑麦草基因组中。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 第一章 文献综述
• 1 多年生黑麦草概述
• 2 转基因技术在黑麦草育种上的应用
• 2.1 黑麦草的组织培养
• 2.2 遗传转化方法
• 3 AVP1 基因与植物抗逆性研究
• 3.1 AVP1 基因概述
• 3.2 AVPl 编码的H+-PPase 结构
• +-PPase 的生理功能'>3.3 H⁺-PPase 的生理功能
• 3.4 AVPl 基因与植物抗逆性的研究进展
• 4 目前转基因过程中存在的问题
• 4.1 体细胞无性系变异
• 4.2 转基因的效率
• 4.3 转基因植株的稳定性
• 4.4 转入基因的局限性
• 5 本研究的意义、目标和内容
• 5.1 选题背景与研究意义
• 5.2 研究目标
• 5.3 研究内容
• 第二章 多年生黑麦草愈伤组织诱导与植株再生
• 1 材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同划割处理的成熟种子对多年生黑麦草发芽率和出愈率的影响
• 2.2 不同2,4-D 浓度对多年生黑麦草不同外植体愈伤组织诱导的影响
• 2.3 不同6-BA 浓度对多年生黑麦草愈伤组织诱导的影响
• 2.4 不同6-BA 浓度对多年生黑麦草愈伤组织分化的影响
• 2.5 继代时间对多年生黑麦草愈伤组织分化率的影响
• 2.6 多年生黑麦草不同品种对愈伤组织诱导和分化的影响
• 2.7 活性炭对壮根的影响
• 3 讨论与总结
• 3.1 不同划割处理的成熟种子对多年生黑麦草出愈率的影响
• 3.2 不同外植体对多年生黑麦草出愈率的影响
• 3.3 植物激素对愈伤组织诱导的影响
• 3.4 植物激素对愈伤组织分化的影响
• 3.5 基因型对愈伤组织诱导和分化的影响
• 3.6 继代时间对多年生黑麦草愈伤组织分化率的影响
• 第三章 农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化及转基因植株的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 培养基和缓冲液的配置
• 1.3 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 筛选剂浓度的选择
• 2.2 农杆菌培养中抗菌素及其浓度的确定
• 2.3 菌液浓度对转化效率的影响
• 2.4 浸染方法和时间对转化效率的影响
• 2.5 共培养天数对转化效率的影响
• 2.6 不同多年生黑麦草品种对转化率的影响
• 2.7 乙酰丁香酮（AS）的浓度对转化效率的影响
• 2.8 抗性植株的筛选和获得
• 2.9 转基因植株的PCR 鉴定
• 3 讨论与总结
• 3.1 筛选剂在农杆菌转化中的作用
• 3.2 抗生素对多年生黑麦草转化的影响
• 3.3 农杆菌接种对多年生黑麦草转化的影响
• 3.4 共培养对多年生黑麦草转化的影响
• 3.5 乙酰丁香酮对多年生黑麦草转化的影响
• 3.6 转基因植株PCR 鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 导师简介